原生质体的培养与体细胞杂交.ppt

第九章 原生质体培养和体细胞杂交 本章大纲 9.1 原生质体的分离与纯化 9.2 原生质体培养 9.3 体细胞杂交 什么是植物原生质体？ 是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料 仍保持植物细胞的全能性 仍能进行植物细胞的各种生命活动 是植物遗传转化的理想受体 膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、细胞核、甚至 病毒颗粒等 9.1 原生质体的分离与纯化 几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体 叶片、愈伤组织、悬浮培养的细胞都可制备原生质体 叶片是最常用的材料 一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系 分离原生质体效果较好 一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为分离原生质 体的材料 9.1.1.2 材料的预处理 (1)暗处理 在分离原生质体前,将在温室内生长5-7周的豌豆枝条取下后,置于维持一定湿度的暗室中预培养1-2天。 获得的原生质体存活率较高,并能继续分裂。 (2)预培养 把羽衣甘蓝叶撕去下表皮，置于又到愈伤组织的培养基上预培养7天，然后再用酶液脱壁。 得到的原生质体量虽低于未经处理的对照组，但培养时分裂频率提高，并很快形成能生根的愈伤组织。 (3)预萎蔫 将叶片置于日光或灯光下2-8h使叶片稍萎蔫，则有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁分离原生质体。 (4)预质壁分离 把材料先放到与酶溶液中糖浓度相同的糖溶液中预培养1h左右，是细胞质壁分离，然后再放入酶液去壁。 加快原生质体的释放，提高原生质体的活力。 9.1.1.3 分离方法 机械分离法 早期研究中借助于利器（如刀等）或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。 ⑴ 常用酶的种类 ① 纤维素酶（cellulase） ② 果胶酶（pectinase） ③ 半纤维素酶（hemicellulase） ④ 崩溃酶（driselase） 一种活力很强的粗酶制剂，同时具有纤维素酶、果胶酶以及地衣多糖酶和木聚糖酶等几种酶的活性。 ⑤ 蜗牛酶（snailase） 主要用于花粉母细胞、四分体、小孢子等中分离原生质体 ⑵ 酶液的配制 使用原则：以用最少的酶制剂种类、最少的量，但能分离得到完整、健康的原生质体为准 使用前需要对酶进行纯化 在酶液中必须加渗透稳定剂以保护原生质体的活力和质膜的稳定性，一般渗透稳定剂浓度为0.35-0.8mol/L 适宜PH：5.4-6.0范围 常用的渗透稳定剂 1、糖醇和可溶性糖 包括甘露醇（常用）、山梨醇、葡萄糖、 蔗糖等 2、无机盐 CaCl2、MgSO4、KCl、KH2PO4或培养基中的无机盐组成 稳定剂中附加钙盐（0.1%）可以增强质膜稳定性 葡聚糖硫酸钾（0.5%-1%）能抑制酶液内某些杂酶和RNA酶的活性，也有助于质膜稳定 加入少量AgNO3能减少酶解时产生的乙烯 加入过氧化氢歧化酶以减轻O2ˉ自由基对细胞膜的损伤，从而提高原生质体的植板率 （3）分离原生质体 ①两步分离法（顺序法）： 先用果胶酶使细胞分离，再用纤维素酶解离细胞壁获得原生质体 ②一步分离法（直接法）： 把一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理，目前多用。 分离需注意： 材料和酶液的体积比： 1:10 温度：25-30℃ 黑暗或弱光条件 一般静置进行，每隔一段时间轻轻摇动几下，也可将培养皿一直放在50r/min的摇床上轻轻振荡来分离原生质体 9.1.2.1 原生质体的纯化 （1）离心沉淀法（沉降法） （2）漂浮法 滤液 原生质体漂浮于溶液表面，杂 质下沉到管底 反复 离心和重新悬浮2-3次，最后用原生质体培 养基洗涤1次后调整到所需密度进行培 养。 原理：高分子聚合物混合液产生两相水溶液，通过离心可使原生质体处于两液相的界面之间 优点：可获得数量较大的纯净原生质体，同时避免了在收集过程中原生质体因相互挤压而破碎 9.1.2.2 原生质体活力的测定 （1）形态特征 形态上完整、含有饱满的细胞质、颜色鲜艳的正常球形 在低渗的洗涤液或培养液中，分离时被高渗溶液缩小的原生质体又恢复原态 胞质内原生质环流或小颗粒内含物的布朗运动程度 （2）活力染色 用0.1%酚番红或Evans蓝染色后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体不着色，而死亡的原生质体能被染上色。 FDA