植物种质的玻璃化超低温保存.doc

植物种质的玻璃化超低温保存 日胞生物学杂志ChineseJournalofCellBiology2005,27:43—45http://www. cjcb,org 植物种质的玻璃化超低温保存 梁宏王起华 (辽宁师范大学生命科学学院,大连116029) 摘要植物种质的玻璃化超低温保存技术已受到广泛重视.玻璃化法主要由装载,玻璃化 保护液脱水,降温,复温,洗涤这5个环节构成.目前已对百余种植物进行过玻璃化冻存研究,但 主要应用于高等植物,而用该法保存藻类获得成功的报道很少.将玻璃化法用于某些藻类种质的 冻存将会有广阔的应用前景. 关键词植物种质;超低温保存;玻璃化 超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存 的理想方法.在超低温(通常指液氮温度,一196℃) 条件下,细胞的全部代谢活动近于完全停止,因而 可以保持种质的遗传稳定性,达到长期保存的目 的.自从1973年Nag等…首次成功地超低温保存了 胡萝卜悬浮细胞以来,国内外已对近200种植物材 料进行了超低温保存【2】,所采用的方法主要包括两 步法,玻璃化法和包埋一脱水法.其中,玻璃化 法是2O世纪8O年代才发展起来并日益受到广泛重视 的超低温保存新技术.所谓”玻璃化”就是将细 胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护 剂组成的玻璃化溶液中,使细胞及其玻璃化溶液在 足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温度,而被 固化成玻璃态(或非晶态),并以这种玻璃态在低温 下保存【41.与传统的超低温保存方法相比,玻璃化 法操作简单,重演性好,避免了一些种质的冷敏感 问题,并且在复杂的组织和器官的超低温保存方面 有较好的应用潜力【5】.但是玻璃化溶液对细胞具有 一 定的毒性,复温后其残余会造成再培养过程中一 部分细胞的死亡.Steponkust1,TowillI1及严庆丰 等[71曾就玻璃化法的研究进展作过论述,王君晖等 IS]也曾就玻璃化法在园艺作物茎尖和分生组织的超低 温保存中的应用价值方面作过报道.近几年来,植 物种质玻璃化法超低温保存的研究又有了重大进展. 1玻璃化冻存植物材料已取得的成果 1985年Rall等[91第一次运用玻璃化法成功保存 小鼠胚胎,证明了这项技术的可行性.1989年 Langis等【lo】和Uragami等…】相继证实了玻璃化法冻存 植物材料同样是可行的.近I5年来,已成功地应 用该法对IO0余种植物材料进行了超低温保存[12I. 冻存材料包括植物茎尖,原生质体,分生组织,合 子胚,细胞等.表I列举了近10年来部分植物材 料的实验结果[2,12-331,有关1994年以前的研究报道 可参见严庆丰等的文章[71.另外,Stillinger等[341就 超速冷却的液体和玻璃化的形成进行了探讨.董轶 锋等【35】对若干常用的低温保护剂实现玻璃化转变的 临界降温速率进行了实验确定,并修正了临界降温 速率的公式.Wang等【361对玻璃化冻存后的水稻胚 胎悬浮细胞的内部结构及其机制进行了探讨. 2玻璃化冻存法的主要过程 本文重点论述植物材料玻璃化冻存方法的5个 主要环节:(1)装载;(2)玻璃化保护液脱水;(3)降 温;(4)复温;(5)洗涤【51.对材料冻存后的再培养 和存活率测定等内容则不做论述. 2.1装载 研究表明,若用玻璃化溶液对抗脱水性较差的 细胞或茎尖直接进行处理,则会因为玻璃化溶液的 渗透压力和化学毒性作用对其造成伤害【241.但若是 在用玻璃化溶液对材料进行处理前,有一个装载的 过程,即用一个较高浓度的冷冻保护剂混合液于室 温下预处理一定时间,进一步降低组织含水量,则 可避免由于渗透压变化剧烈对材料造成的伤害【lSl. 装载溶液多采用2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的混合 液[15,16,19.22,24,25,28:1,也有的采用稀释的玻璃化溶液[2,13.1引. 但有些材料,如柿休眠茎尖,则不需要装载处理[221. 可见,在实验中是否需要装载这一步骤要根据材料 的具体生理特性来决定. 另外,某些实验中,在对材料进行玻璃化冻 收稿日期:2004—06.07接受日期:2004.09.17 国家自然科学基金(NoNo资助项目 通讯作者.Tel:0411E—mail:qihua_mail@163.com PVS2:30%甘油+l5%EG+l5%DMSO+0.4mol/L蔗糖;EG:乙二醇;DMSO-二甲基亚砜;I:一步法;II:悬滴法与一步法结 合;III:用半固体氮降温 存前,通常用低浓度的冷冻保护剂进行预培养『51. 预培养的目的是使材料脱水,增加含糖量和提高细 胞膜在严重脱水条件下的稳定性【l6】.颅培养的方式 依材料的不同而不同.多数是在含有0.3mol/L蔗糖 的培养基中4～25℃培养