利用响应面法优化放线菌素X2发酵培养基.ppt

利用响应面法优化放线菌素X2发酵培养基 江西农业大学生物工程系 熊智强 涂国全教授 2005.10 报 告 提 纲 前言 材料与方法 结果与分析 小结与讨论 前 言 江西农业大学生物工程系应用微生物研究室从土壤中分离筛选到一株链霉菌，简称链霉菌702,其所产生物活性物质对棉花枯萎病菌有较强的抑菌活性，进一步测定它的抗菌谱，发现其所产生生物活性物质抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，同时还能抑制霉菌和酵母菌。稳定性的研究测定表明其对热和紫外线稳定，在pH3-pH12条件下稳定。这些初步研究结果已显示了其作为抗菌剂的广阔前景。 从该菌的发酵产物分离提取和纯化其抗细菌活性物质，经紫外、质谱和核磁共振谱和X衍射等测定结果表明，该活性物质为放线菌素X2 。但要作为抗菌剂应用于市场，首先要提高其产量，因此优化发酵培养基是其中的关键环节之一。我们采用响应面法优化链霉菌702产放线菌素X2发酵培养基，为该菌的产业化开发提供现实依据，本文报道了这一研究结果。 1、材 料 1.1 供试菌株 ①链霉菌702（Streptomyces 702）：由江西农业大学生物工程系应用微生物实验室分离筛选获得，甘油管保存。②抑菌测定指示菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 1.2 培养基 1.2.1 供试菌斜面、平板和茄子瓶培养基：高氏一号培养基 1.2.2 种子培养基(g/L) 玉米淀粉10、玉米粉30、黄豆粉10、硫酸铵0.5、碳酸钙6， 豆油2mL/L； 1.2.3 发酵培养基(g/L) 玉米淀粉20、玉米粉20、葡萄糖20、黄豆粉15、硝酸钾2.5、蛋白胨5、硫酸铵2.5、磷酸二氢钾0.3、氯化钠3、碳酸钙5， 豆油10mL/L； 1.2.4 指示菌斜面、平板培养基：药典Ⅱ号培养基。 1.3 放线菌素X2（含量99.47%）:由本实验室提供。 2、方 法 3、结 果与 分 析 4、小 结 与 讨 论 谢 谢！ * * 中国微生物学会2005年学术年会 2.1链霉菌702种子培养 取链霉菌702试管斜面制成孢子菌悬液，取适量体积接种于装有20mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm回转式摇床振荡培养48h。 2.2链霉菌702摇瓶发酵培养 取适量链霉菌702种子培养基接种于装有40mL发酵培养基的250mL三角瓶中,30℃，200rpm回转式摇床振荡培养96h。 2.3 链霉菌702发酵液生物效价测定：一剂量法 发酵液效价的测定采用一剂量法在金黄色葡萄球菌指示菌平板上进行抑菌测定，以放线菌素X2标准品浓度为纵坐标，以校正后的抑菌圈直径为横坐标，得到放线菌素X2标准品的标准曲线和线性回归方程。链霉菌702发酵液用无水乙醇稀释浸提，离心。上清液稀释到一定倍数后，作为抑菌测定液。按照放线菌素X2标准品标准曲线的制备方法求得发酵液的抑菌圈直径平均值的校正值，再根据相应标准曲线和发酵液样品的稀释倍数，求得每毫升样品所含的放线菌素X2的单位数。 2.4 实验结果统计分析 采用SAS Version 6.2软件对实验数据进行拟合和方差分析， 采用MATLAB 6.5软件进行偏导求模型极值。 3.1.1 应用全因子实验设计筛选重要因素 选用四因素二水平全因子实验设计筛选影响链霉菌702产放 线菌素X2的重要因素，需要16次实验，中心点做4次重复实验，共 需20次实验。每个实验做三个重复，实验结果中的生物效价取三 个重复的平均值。实验设计及实验结果见表1和表2。 由实验结果可以看出，放线菌素X2效价随实验条件的改变差异很大。通过SAS Version 6.2软件进行回归分析可以得到一次拟合回归方程为： Y=186.85-1.621 X1+11.95 X2+13.51 X3+0.38 X4 由表4可知，F检验非常显著，用方程描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量与全体自变量之间的线性关系显著，且X2因素（黄豆饼粉）和X3因素（工业蛋白胨）对链霉菌702产放线菌素X2影响极显著，而其余两因素对链霉菌702产放线菌素X2影响不显著。 3.1.2 应用最陡爬坡实验法接近重要因素的最优水平 最陡爬坡的方向可由上述方程及回归分析确定，X2因素 （黄豆饼粉）和X3因素（工业蛋白胨）在99%的概率水平上差异显 著，且系数都为正。这说明，适当增加黄豆饼粉和工业蛋白胨的用 量，对放线菌素X2的产量提高有促进作用。实验设计及实验结 果见表5，从表5中可以看出，第5组实验中放线菌素X2的生物效 价最高，这说明，最优点在第5组实验附近。 3.1.3应用中心复合设计确定重