张易祥微生物遗传学实验.ppt

实验八 微生物遗传实验 ----抗药性突变株的分离 一 实验目的 掌握微生物变异的原理 了解紫外线诱变筛选突变菌株的方法 学习用梯度平板法分离抗药性突变株 二 实验原理 基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用。 1、自发突变---（抗药性突变） 1）基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。 2）微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是引发突变的诱导物。 3）因而在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上生成菌落。 4）将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以得到所需要的抗药性菌株。 5）抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是非常重要的。 6）为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗氨苄青霉素突变株。 2、紫外线诱发突变 紫外线是一种常用的物理诱变因素，主要作用于DNA，引起DNA损伤； 为避免光修复，处理后的微生物应放暗处培养。 三 实验步骤 1、抗药性菌株的筛选(p.167) （1）取一个已经灭菌的空大平皿，把培养皿斜放(一边垫起)，在无菌条件下倒入不含药物的底层培养基（10mL LB培养基,已分装好，保温在灭菌锅中，要快）； (在超净工作台做) （2）待平板中的培养基凝固后将平皿放平，再倒入含有链霉素的上层培养基10mL（含有链霉素200u/mL：现配现用，原液20万单位，吸50微升加入50 ML培养基）；2个组做，8个组用。 (在超净工作台做) 在皿底用箭头标记,示药物浓度从低到高。 注意：抗生素要在培养基冷却到50度左右再加； （3）取一支大肠杆菌液体培养物，用移液枪移取200微升菌液到梯度平板上，进行涂布。（实验室做） （4）将平板倒置于37℃培养2天；观察经一次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。 后续实验（不做） （5）选择平板上1～2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触单个菌落朝高药物浓度的方向划线。 （6）将平板倒置于37℃培养2天；观察经二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。 2、紫外线诱变枯草杆菌（在实验室做） 1）取菌悬液5ml，放入无菌空平皿（大平皿），去盖置于紫外灯下照射3min（15W,距离30cm）；2个组做，8个组用。 2）稀释：用10倍稀释法把经过照射的菌悬液在无菌水中（已分装好，每试管9mL）稀释成10-1---10-6。同样将未处理的菌液进行同样稀释做对照； 3）分别取10-4，10-5，10-6稀释菌液150微升各涂一个小平板(3个对照，3个实验)；需用淀粉培养基 4）培养： 将上述平板用黑纸包好，置37℃培养48h。 5）观察诱变效应 选取菌落较少的平板，加几滴碘液，观察透明圈大小，同时与对照平板比较。 思考题： 1、梯度平板中部的单个菌落被划线，并二次培养的目的是什么？ 2、如果要计算紫外线诱变的致死率，该如何设计实验？ * *