毛细管的电泳原理.ppt

第二章 毛细管胶束电动色谱 电解质中加入表面活性剂(surfactant，例如SDS)，使之形成胶束（Micelle），样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离 ，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。 毛细管胶束电动色谱原理 SDS - + EOF Micellar Electrokinetic Chromatography (MEKC) 七种青霉素的分离 CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5 (B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln. 胶束电动色谱的特点 优点 增加对弱极性物质分离的分离度 在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用 缺点 稳定性不佳，达到好的重复性比较困难 第三章 毛细管凝胶电泳 毛細管內先填充凝胶(例如polyacrylamide或cellulose)，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离。 主要用于核酸片断及蛋白分子量分析 毛细管凝胶电泳 CE双链及单链核酸分析 45-寡核苷酸质控 1.0 2.0 3.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 23 24 25 26 27 28 29 30 30 31 32 33 34 IS 21 10.0 15.0 Relative Fluorescence Intensity dsDNA片段 (72 bp-12 Kbp) CE-SDS蛋白分子量分析 第四章 毛细管等电聚焦 第五章 亲和毛细管电泳-分离条件基于CZE 当在CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择与CZE等相同。 用于研究 分子间相互作用测定，分子构型变化 特定物质检测 活性物质筛选 ACE测定分子间结合常数与解离速率 JAK2与SH2-B之间的相互作用研究 CE药物筛选 ACE用于相互作用筛选 适体Aptamer类似于抗体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临床诊断应用潜力 目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法筛选得到的 IgE HIV type 1 reverse transcriptase Thrombin Anti-thrombin III Taq DNA polymerase ACE用于相互作用筛选 传统筛选方法如亲和色谱或者CEC筛选一个Aptamer需要4-6周 而CE只需要几天就可以了，大大提高了筛选速度 --MicroScale Bioseparations 2006 第六章 检测器选择 小分子检测 大分子检测 CE检测器种类及性能 小分子检测 有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器 无紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器 有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器 需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测 大分子检测 蛋白、核酸 可以首先选择紫外检测器 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测 多糖 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测 第七章 分离条件选择流程 分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考： 第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质； 第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，若无样品信息可先选CZE； 条件选择流程 第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外吸收； 第四步，确定样品处理方式，包括衍生方案以及离心过滤除蛋白等； 第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75μmID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围; 条件选择流程 第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等； 第七步，优化其他操作参数，如毛细管尺寸、分离电压和温度等；