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地高辛标记系统 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 地高辛的结构 地高辛标记与检测的原理 利用不同的方法将Digoxigenin-11-dUTP掺入到新合成的探针DNA 或RNA链中或寡核苷酸的末端 探针与目标DNA杂交后，用连接有碱性磷酸酶或其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探针 根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检测（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化学发光检测(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或化学显色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates))的方法将探针杂交的位置显现出来 地高辛标记系统的特点 标记和检测技术安全 标记的探针稳定可以保存一年 杂交液可以反复使用数次 随机引物标记 利用随机引物标记的方法将 Digoxigenin-11-dUTP掺入到新合成的DNA 链中。 反应体系中包含六碱基随机引物、dNTP(含有碱性条件下不稳定的Digoxigenin-11-dUTP，Klenow 酶及反应所需的Buffer 与放射性同位素标记方法相同之处 标记和杂交技术相似 高灵敏度 低背景 可以标记DNA、RNA 或Oligonucleotides 与放射性同位素标记方法不同之处 无害,安全 产生的废物不需特殊处理 需要分析的时间短 探针稳定 DNA的地高辛标记和检测步骤 探针DNA 的标记及标记效率测定 DNA的转移和固定 杂交 免疫测定 洗去膜上探针再次杂交 操作基本要求 工作环境及试剂要干净：（1）试剂要高压灭菌；（2）含有SDS 的试剂要过滤灭菌；（3）TWEEN20应加到预先灭菌过的试剂中 用具要干净：用之前一定要清洗得非常干净 操作尼龙膜时要小心（1）戴无尘手套；（2）用干净的镊子夹取膜的边缘 探针模板DNA的要求 质粒DNA纯度要高。最好用高纯度的质粒DNA 分离和纯化试剂盒纯化或用苯酚/氯仿抽提去除残留的蛋白质。纯化后的模板用H2O 溶解 用作探针模板的DNA应是线型的，大于100bp，如果模板DNA 5kb则应用识别位点是4bp的限制性内切酶切割成较小片段（切割后要纯化） 模板的量：10ng-3μg，如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，标记模板的最低量要300ng（探针浓度：25ng/ml杂交液） 如果做基因组DNA southern blotting, 应将克隆倒载体上的DNA 酶切后琼脂糖电泳分离或PCR扩增，得到的片段都需要用试剂盒纯化 DIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3 20-25bp 可插入一个DIG-dUTP 标记的探针是基于模板的不同区段、不同长度的DNA 片段 可以探测0.03-0.1pgDNA 标记步骤(20μl) 将10ng-1μg 模板DNA用无菌去离子水补足至16μ l。 沸水浴或干浴锅98 oC 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取4 μ l至变性DNA管，混匀并离心。 37 oC温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。 停止反应，加2 μ l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 oC加热10分钟。 本次实验标记步骤(10μl) 将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 μ l。 沸水浴或干浴锅98 oC 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取2 μ l至变性DNA管，混匀并离心。 37 oC温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。 停止反应，65 oC加热10分钟。 探针标记效率检测 目的是确定杂交中使用正确的探针量，探针用量太多会引起背景太深，用量太少则无杂交或杂交很弱 检测流程 将地高辛标记好的探针系列稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，杂交温度下温育过夜； 用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色； 比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。 试剂准备（1） Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25℃ stable. Removal of unbound antibody. Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20℃)0 15-25℃ stable. Dilution of Bloc