【实验】DNA的粗提取与鉴定.doc

PAGE 第= Page 2*2 - 1 3页 选修3补充材料 共= SectionPages 2*2 4页 第= Page 2*2 4页 选修3补充材料 共= SectionPages 2*2 4页 【实验】DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 1.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl浓度的不同而不同。当NaCl的浓度为0．14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的其他许多物质溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取含杂质较少的DNA。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色；DNA还有遇甲基绿溶液被染成蓝绿色的特性。上述两种方法均可用于鉴定DNA的存在。 二、材料用具 鸡血细胞液；铁架台，铁环，镊子，三脚架，酒精灯，石棉网，载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量筒（100mL，1个），烧杯（100mL，1个，50mL、500mL各2个），试管（20mL，2个），漏斗，试管夹，纱布；体积分数为95%的酒精溶液（实验前置于冰箱内24h），蒸馏水，质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol/L和0.015mol/L的氯化钠溶液，二苯胺试剂 三、方法步骤 步骤 操作方法 原理 制备鸡血细胞液 ↓ 取0.1g 防止血液凝固，使血细胞与血浆分离 提取细胞核物质 ↓ 取20mL蒸馏水与约5～10mL的鸡血细胞液混合并充分搅拌，然后用单层纱布过滤，取滤液于烧杯中 使细胞过度吸水而破裂 溶解DNA ↓ 取2mol/L的NaCl溶液40mL与上述滤液混合后，用玻璃棒沿一个方向搅拌1min DNA在高浓度氯化钠溶液中溶解度最大 析出DNA并滤取 ↓ 沿烧杯内壁慢慢加入蒸馏水并轻轻搅拌，至白色丝状粘稠物不再增加时停止加水，然后用多层纱布过滤，取纱布上的粘稠物 DNA的溶解度随氯化钠溶液浓度的降低而降低 DNA的再溶解 ↓ 用镊子夹取纱布上的粘稠物放入20mL浓度为2mol/L氯化钠溶液中，搅拌至完全溶解，然后用两层纱布过滤，取其滤液放入小烧杯中 DNA在高浓度氯化钠溶液中溶解度最大 提取较纯净的DNA ↓ 取95%的、冷却的酒精50mL与滤液混合搅拌，待出现丝状物时用玻璃棒将其卷起 DNA不溶于酒精，出现沉淀 DNA的 鉴定 取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为0．015mol／L的NaCl溶液5mL，将丝状物溶解。然后放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。 DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色 四、常见问题分析? 1.从鸡血细胞核中提取的物质是DNA吗？ 在鸡血细胞中加入蒸馏水，并且搅拌，利用渗透作用原理使鸡血细胞破裂，搅拌进一步促进了鸡血细胞的破裂，于是释放出其中的DNA，当然也有少量的RNA，还的蛋白质。因此，释放出的物质是DNA、RNA和蛋白质的混合物，不仅仅只有DNA。 2.怎样提高血细胞因低渗而破裂的效率？ 血细胞的细胞膜对低渗溶液有一定的抵抗能力，这称为渗透脆性。一般而言，血细胞与蒸馏水相混合而使血细胞处于极度的低渗环境之中，细胞因大量失水而致最终破裂并释放出胞内物（包括细胞核）。为促进细胞在低渗条件下破裂，可以辅以快速而有力的搅拌，使之受机械震荡而更易破裂。 3.怎样才能把血细胞释放的DNA滤入收集的滤液中？ 这一步较难处理，在过滤过程中常常发生因粘稠的果胨样物质堵塞过滤纱布的网眼而使后续的过滤难以完成，很多DNA没能滤入滤液中，这是造成失败的主要原因之一。 解决的方法有：过滤时待过滤溶液倒入漏斗的速度应缓慢，以免沉积于溶液中层的胶状物一下就把纱布堵住，使过滤不能完成； 一旦出现大量胶状物使过滤不能进行下去，切忌用力挤压而使胶状物也滤入滤液之中，可以把胶状物重新用适量的2mol NaCl溶液进行搅拌，使其中的DNA得到溶解，然后再进行过滤。 4.实验中看到的丝状物的粗细是不是DNA分子的直径呢？ 不是。因为DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA分子聚在一起形成的。 5.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程中DNA的损失。同理，玻璃棒有吸附DNA的作用，可通过缓缓旋转玻璃棒的方法卷起浓缩后