葡萄球菌肠毒素C纯化探究总结.pptVIP

葡萄球菌肠毒素C的纯化研究 主讲人 鲍行豪 研究人员:鲍行豪 夏占强 蓝明玉 一、培养基及培养条件的优选 二、用分子截留方法浓缩肠毒素原液 三、用DEAE-纤维素（系Pharmacia 产品）柱层析作第一步提取 四、用Sephadex G-75分子筛层析柱进一 步纯化 五、纯化前后SET-C的SDS鉴定 六、纯化后的SET-C分子量测定 七、对SET-C纯化品的N末端氨基酸测定 前言 为了检测“金葡素”制剂中有效成份葡萄球菌肠毒素C(SET-C),我们对提纯SET-C方法进行了较为系统的研究。经多次试验，认为按四部法提取SET-C能获得较好效果，并对SET-C的某些生物学特性作了探索。现总结如下： 一、培养基及培养条件的优选 我们比较了猪心胨汤（原生产“金葡素”用培养基）、酶解猪心汤和胰酪胨综合培养基，接种复壮后种子液，以静置与摇瓶（156r/min）二种方式作48小时培养，取出以高速离心法除去菌细胞，再用0.45um微孔滤膜过滤除去残存菌，取其无菌滤液用反相胶乳凝集试验（RPLA）测SET-C含量。 结果证明：胰酪胨综合培养以摇瓶培养金黄色葡萄球菌，其产生SET-C最高。因此，我们在作SET-C提纯时就决定采用胰酪胨综合培养基及摇瓶培养方式来制备肠毒素原液。 二、用分子截留方法浓缩肠毒素原液 采用中科院上海原子核研究所装配的POST-FLO TM Ⅱ型流动循环超滤泵，以10000dalton超滤膜对肠毒素原液进行截留浓缩，除去原液中水份及10000dalton以下的小分子物质，使原液浓缩达20倍以上，离心除沉淀，取其上清，经透析作为纯化SET-C的原液。 三、用DEAE-纤维素（系Pharmacia 产品）柱层析作第一步提取 一般要求DEAE-纤维素40～100目，临用前过筛，再以蒸馏水漂洗，去除细微粒子。用1%NaoH和和1%HCL交替处理后直至洗涤液呈中性。再用0.01mol/L PH5.4 PB冲洗平衡，装柱。柱大小为4.1×42cm。装柱时切忌气泡进入，装好柱后用同一PB缓慢洗涤使整个柱内达到平衡，然后上样。 即将上一步浓缩透析过的SET-C原液缓慢加入使全部入柱后。先用PH5.0 0.01mol/L PB洗涤，使有色液体流尽。其后作分管收集，每10分钟收集一管，其量为7.5ml，对收集液逐管在OD280nm紫外分光自动检测仪测蛋白峰出现管数。 其后相继换用PH 6.6、0.06mol/L PB和PH 6.8，0.2mol/L PB分步洗脱，洗速为45ml/hr，每管仍用OD280nm紫外分光自动检测仪测洗脱液蛋白吸收峰。并对各峰洗脱液合并，再用反相胶乳凝集试验（RPLA）检测是否有SET-C存在，合并蛋白峰。收集结果证明SET-C 在第Ⅱ峰，结果见图1，并对Ⅱ峰用PEG浓缩至一定量，提供下一步纯化。 图1：用DEAE-纤维素层析结果 四、用Sephadex G-75分子筛 层析柱进一步纯化 对收集经DEAE-纤维素层析分离的第Ⅱ峰洗脱液合并，用PEG浓缩，将浓缩液置透析袋中，用0.01mol/L PH7.4 PB透析平衡后，将第一步浓缩透析液再通过事先准备好的Sephadex G-75分子筛柱(2.6×30cm)过柱。 上样后用0.01mol/L PH7.4 PB洗脱，洗脱液出现一个蛋白峰，用RPLA检测毒素即在此峰，收集Ⅰ峰混合，浓缩。结果见图2： 图2：用Sephadex G-75分子筛结果 对截留后浓缩液及通过DEAE纤维素柱层析与Sephadex G-75分子筛过柱后各项内容的变化情况见表1：表1：SET-C的提纯及回收率 五、纯化前后SET-C的SDS鉴定 对分子截留浓缩的截留原液，经DEAE-纤维素初步提以的浓缩液及再经Sephadex G-75分子筛纯化后浓缩液，在同一块10%的SDS凝胶板上，分别滴样进行电泳后染色观察，结果见图3： CBA （A：浓缩液 B：经DEAE柱 C：经Sephadex G-75柱） 图3 SET-C各部样品的电泳图谱 六、纯化后的SET-C分子量测定 对纯化后的SET-C制品与已知分子量标准蛋白质在同一块10%SDS凝胶板进行电泳后作染色检定，结果见图4、图5 （M: standard protein S: sample） 图4 SDS测定肠毒素C分子量 图5 SETC分子量测定结果 从图4、图5中可见纯化SET-C在PAGE中呈现单一条带，通过与标准蛋白分子量比较计算，SET-C的分子量约在28000dalton左右。