肝炎病毒HBV HCV基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究.docx

肝炎病毒(HBV、HCV)基因诊断芯片的研制和新型 肝炎病毒(HBV、HCV)基因诊断芯片的研制和新型 肝炎病毒SENV的实验研究 中文摘要 HBV和HCV是临床上最常见、危害最大的两种肝炎病毒，其长期持续的慢性 感染与肝硬化、肝癌的发生发展密切相关。随着人们对肝炎病毒认识的不断深入， 尤其是肝炎病毒基因组学研究的进展，使临床上现有的血清免疫学方法和以单一 PCR技术为主的检测方法其局限性越来越明显，由于不能真实、全面地反映患者体 内病毒基因组的各种变异和动态变化，对患者个体的针对性诊断和治疗也受到很大 限制。为及时将肝炎病毒的基因研究成果应用于临床实践，需要利用新的分子生物 医学技术，研究和开发肝炎病毒的新型诊断方法和诊断试剂。据此，我们重点研究 了HBV和HCV基因诊断芯片的制备、应用，以及新型肝炎病毒SENV的实验研究。 本文涉及的实验方法包括生物信息学分析(即芯片上探针和PCR引物的设计、 测序序列的检索和比对)、探针和PCR弓l物的合成、PCR产物直接测序、基因芯片上 探针的点样制备方法、血清中病毒的提取方法、PCR扩增和地高辛标记、分子杂交及 显色、芯片杂交结果的数据处理等。芯片制备过程中的优化环节包括：尼龙膜型号 和探针固定照射剂量的选择，探针3’末端加尾碱基数的确定，利用探针的互补寡核 苷酸序列和部分PCR产物的测序验证芯片杂交的特异性，利用PCR扩增直接参入地 高辛信号分子，分析其长度、浓度及杂交时间对杂交信号的影响，比较了HBV标本 的不同处理方法和不同PCR引物组合的扩增效率。经过二年多的反复实验研究，初 步完成HBV基因芯片、HCV基因芯片和HBV、HCV联检芯片的制备。 在HBV基因芯片的研制过程中，先后制各了娜V050S、HBv-90S、HBV-120S、 HBV-P／S区75S和HBV-C／X区25S等不同点阵数的基因芯片。最早的HBV-450S芯 片包含的基因信息最丰富，理论上可检测I-IBV的7种基因型、4种血清亚型、4个P 基因耐药相关的突变位点、2个S抗原突变位点、6个C区变异和X区的缺失突变， 但部分探针特异性较差。在随后的改进中，HBV-P／S区75S是目前临床实验研究较 好的芯片，对基因型、血清亚型和拉米夫定耐药突变均能特异检测。同时，利用制 备的HBV基因芯片，对45例纳入葛兰素威康公司评价新药拉米夫定疗效临床研究 的乙肝患者、270例三中心医院的门诊慢性乙型肝炎患者和466例来自6个不同地区 的乙型肝炎患者进行了拉米夫定耐药变异株和基因型的检测分析。HCV基因分型芯片的设计采用5’非编码区和相邻的核心区序列，5’非编码区的 的乙型肝炎患者进行了拉米夫定耐药变异株和基因型的检测分析。 HCV基因分型芯片的设计采用5’非编码区和相邻的核心区序列，5’非编码区的 探针主要用于型的鉴别，而核心区的探针区分亚型，利用20个探针可一次性检出 HCV的15个常见亚型。通过对76例HCV阳性血清的检测表明，1b型64例，2a 型11例，3a型l例，未见混合型感染和不能区分亚型的标本，6例不同基因型标本 的测序结果也验证了芯片杂交结果的准确性。 SENV是2000年末发现的一种新型肝炎病毒，目前对其各方面的认识还有待深入， 致病性也存在争议。本文利用SENV的5’端非编码区和ORFl区设计两对套式PCR引 物，检测SENV的感染状况。结果表明，两组引物除在新生儿中未检测到SENV感染 外，而在我国不同地区、不同年龄和各种患病人群中均有较高的检出率，5’端非编 码区引物的检出率(77．1％～89．2％)高于ORFl区引物的检出率(26．1％～50．0％)。 进一步对两个区域38个PCR产物测序和分子系统进化树分析表明，PCR扩增的产物 不仅有SENV亚型序列，也包括TTV亚型序列，使用的引物越保守，越难以区分检测 结果。 总之，经过近三年的实验研究取得以下成果：①建立了具有独立自主知识产权 的从微点阵制备到PCR标记、芯片杂交检测和软件分析的基因芯片操作平台。②自 行设计了HBV基因分型和基因变异诊断芯片、HCV基因分型芯片和HBV、HCV联检芯 片。初步临床应用结果表明，该芯片具有较好的准确性和特异性，与测序结果相比 较，HBV芯片准确性达95．8％，HCV芯片准确性达98．3％。③实验研究表明，SENV可 能与肝病不相关或条件致病，并且该病毒家族的基因型分类有待进一步的探讨。 关键词：基因芯片 乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒聚合酶链反应SEN病毒 2 Prepared Prepared of hepatitis virus(HBV,HCV)oligochip and experimental study of a new hepatitis virus SENV Abstract HBV and