国家自然基金项目-诱导多能干细胞（iPS）的重编程机制.doc

PAGE PAGE 18 项目名称： 诱导多能干细胞（iPS）的重编程机制 首席科学家： 起止年限： 2009.1至2013.8 依托部门： 中国科学院 一、研究内容 基于以上的立项依据，本项目的主要研究内容将集中在以下几个方面： iPS细胞被重编程的分子机制 从核移植（克隆动物的基础）我们得知，细胞核可以被胞质重编程。iPS的出现说明四个因子（或其他几个因子）可以重编程体细胞。目前我们不知道使重编程发生的关键分子事件是什么。我们将从表观遗传修饰的改变、microRNA的变化和基因表达谱的变化几个方面来研究iPS中重编程的分子机理。 1.1 表观遗传变化 基因表达活性调控的机制主要是通过染色质水平的化学修饰（包括组蛋白上的修饰），形成有转录活性的常染色质和无转录活性的异染色质区域。染色质组分（组蛋白与DNA）的各种修饰在细胞内由不同的酶类催化完成。胚胎干细胞、成体细胞或已分化细胞具有各不相同的特异性的染色质修饰谱式。这些修饰谱式在体细胞去分化时发生逆转（重编）。已有实验证明MEF细胞的Oct4和Nanog基因的启动子在iPS形成过程中发生去甲基化。由于DNA甲基化引起基因转录沉默，因此去除全能性基因上的DNA甲基化是激活全能性基因的重要步骤。也是iPS诱导过程中一系列分子事件中的一大限速步骤。同时，由于在转录调控中，DNA甲基化和组蛋白的修饰属于一起发挥作用的共同体，因此，研究DNA甲基化在iPS中的作用，必须要研究该过程中组蛋白修饰的变化。我们将在iPS诱导系统中，利用ChIP-on-chip芯片研究分析和发现组蛋白修饰的动态变化。在此基础上，通过有目的地改变DNA甲基化和组蛋白修饰的动态平衡，探索简化iPS诱导方法的可能策略，如不依赖反转录病毒导入外源转录因子等。阐明体细胞重编程过程中各分子事件间的相互联系,进而为iPS技术革新提供依据。 1.2 microRNA的改变 诱导已分化的体细胞成为多能性的干细胞(iPS)是一个复杂的过程。最近的研究发现microRNAs在维持干细胞的多能性发挥了重要的作用, 破坏microRNA会导致胚胎干细胞分化异常以及精原干细胞在体内的缺失。研究发现，小鼠和人的胚胎干细胞拥有一套特异的microRNAs，它们定位在染色体上成一簇，并与Oct4,Sox2和Nanog有相互作用，提示这些microRNAs参与维持胚胎干细胞的多能性。因此我们推测microRNAs在iPS的诱导和维持中也有重要作用，是全面解析iPS诱导分子机制不可缺少的一部分. 我们将进行以下的研究：1，用Lentiviral病毒载体来诱导表达Oct4，Sox2，Nanog，Lin-28，建立可重复的iPS诱导系统,分析和发现general microRNAs和胚胎干细胞特异的microRNAs被激活的时间图谱；2，然后选择在不同时间激活的胚胎干细胞特异的microRNAs与Oct4，Sox2，Nanog共转染分化细胞,分析相应的microRNA是否对iPS的诱导有促进作用；3，在前述基础上，选择有明显促iPS诱导作用的microRNA，以此为探针，寻找其在调控多能性干细胞的信号传导和表现修饰的靶点以及调控机制。 1.3 iPS中的信号通路 iPS细胞是通过在成体细胞中转入四个因子（即转录因子）实现的。除了表观遗传学修饰改变以外，转入的转录因子必然引起相应的基因转录激活等一系列事件。因此我们将对iPS细胞在基因表达水平上进行广谱性的研究，了解体细胞重编程过程中有哪些基因表达发生显著改变；这些显著改变的基因具有怎样的时序表达规律；这些显著改变的基因之间可能形成哪些关键的调控网络，它们决定着重编程的全过程以及细胞的命运。我们将1. 分析体细胞、iPS以及胚胎干细胞（ESC）的基因表达差异，确定显著性上调的和下调的基因；2. 分析体细胞在重编程过程中不同时间的基因表达变化，确定每一天显著性上调和下调的基因，从而明确基因表达在整体水平上的时序性；3. 根据以上结果分析确定的基因，分别按重编程过程中细胞改变最显著的5个方面，即细胞周期，能量代谢，染色质DNA甲基化，组蛋白修饰以及细胞黏附分子，进行聚类，获得在以上5个方面基因表达变化最为显著的亚群，根据文献中的已知基因功能信息，初步确定可能的基因表达调控网络；4. 利用定量PCR结合过表达或shRNA下调目的基因表达，验证以上分析结果中的基因表达变化和调控网络模型。此外，我们将关注人类iPS细胞形成过程中，维持hESCs全能性及自更新至关重要的Activin，FGF信号通路的表达改变情况：其表达变化是否被Oct4，Nanog，Sox2和Lin28等外源基因调控；其表达改变是否对iPS细胞的形成所必需。在人类iPS细胞系形成之后，Activin，FGF信号对其正常维持及扩增是否起关