免疫学实验方法医疗课件.ppt

siRNA 19 bp duplex 2 nt 3’ overhangs 21 nt siRNA实验设计 原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原（抗体）标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光标记物作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 结果判断 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型 Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1–/– but not TNFR1–/–/R2–/– mice. and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sections were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor. TNFR1–/– TNFR1–/–/TNFRR2–/– 成败的关键因素： 组织的固定、包埋 抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间） 非特异性抗原的封闭 内源性酶或自发荧光的消减 显色 思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？ 五、免疫印迹技术 –Western Blotting（分子生物学实验方法） 一. 蛋白质样品的提取分离 二. 蛋白质样品的定量 三. 制备SDS－PAGE胶 四. 转移电泳及免疫印迹 五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件 imageJ或Quantity One 免疫学三大工具比较 免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。 ELISA用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度非常高。 Western Boltting 先要进行SDS，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。 ELISA与Western Blotting比较 WB可以看到特异性的条带，但是定量比较麻烦； ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信； WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到； WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测； WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而ELISA无能为力； WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。 免疫共沉淀（Co-IP) 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。 六、流式细胞术 (Flow Cytometric analysis) Beckman FC500流式细胞仪 测量对象大小: 悬浮在溶液中的相互离散颗粒 大小范围：0.2μm - 300 μm 高等真核细胞 FCM的应用特点: （1）多参数定量分析每一个细胞； （2）细胞分选；