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探寻qPCR的成败分水岭 北京全式金生物技术有限公司 荧光定量PCR开篇 荧光定量PCR的理想结果 荧光定量PCR的理想结果 荧光定量PCR的起源 1992年，日本人Higuchi在一次报告中提出荧光实时定量PCR技术。当时使用的标记染料是EB，因其可以插入到双链核酸中受激发光。这样，在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台实时定量PCR仪就诞生了。在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，考虑到PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。 1995年，美国的PE（Perkin Elmer）公司率先研发出来TaqMan技术，第二年，首台荧光定量PCR检测系统问世。随后，这种通过检测PCR每个循环的荧光强度，使用某些特定的数学算法用于核酸定量的技术开始得到广泛应用。 荧光定量PCR 的优点 定量类型的选择 定量—对某一样品的量的具体确定—绝对定量 定量—不同时间、不同处理的比较—相对定量 荧光定量PCR的实验方法 荧光标记引物和探针：利用荧光共振能量传递或其它一些荧光淬灭的形式来保证仅在扩增产物出现时特异的荧光才能被监测到。 DNA 结合染料 荧光定量PCR的实验方法 荧光定量PCR的主要方法 TaqMan 探针法 DNA结合染料法（SYBR Green I 法） 荧光定量PCR开篇 完整的荧光定量PCR实验 荧光定量PCR的“三驾马车” 最常见的荧光定量试验都是基于RNA提取，反 转录和PCR扩增这三项技术基础之上的。 RNA RNA的质量是qPCR 实验重复性最重要的决定因素 注意试剂、耗材及操作，避免RNA酶污染 使用提取效果好的RNA提取试剂，避免基因组污染 设计跨内含子的引物，避免额外的易损失RNA的处理 反转录 若要得到较长的或全长的cDNA转录产物，MMLV来源的反转录酶要好于AMV来源的反转录酶。 MMLV来源的反转录酶经过基因突变后具有更低的RNase H活性，避免第一链合成过程中RNA/DNA杂交体中的模板RNA被降解。AMV来源的反转录酶突变率比较高。 一步法需使用基因特异引物。 两步法需使用oligo(dT)引物、随机引物,这两者的组合或基因特异引物。 随机引物 oligo(dT)引物 oligo(dT)引物和随机引物的混合物 基因特异引物 A real-time polymerase chain reaction-based evaluation of cDNA synthesis priming methods. Analytical Biochemistry 322 (2003) 287–291. PCR扩增 热启动酶能提高反应特异性和灵敏度 荧光定量PCR的“三驾马车” 有好的鞋子才能走得快，有好品质的车马才能帮 您走的更远。 荧光定量PCR开篇 如何合理地设置荧光定量PCR反应？ qPCR实验的第一步：检验qPCR体系能否达到实验要求 荧光定量PCR参数解析--扩增曲线 基线：采用前15个循环信号作为荧光本底信号。 阈值：缺省设置3～15个循环的荧光信号的标准差的10倍。 指数期，每个循环PCR产物量大约增加一倍。 平台期，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，产物增长速度变慢，反应进入平台期。 荧光定量PCR参数解析-- CT值 CT值代表初始循环数。荧光定量PCR反应中的3-15个循环，有荧光但没有足够的扩增产物，荧光处于背景水平。当产物累积到一定量时，荧光信号强度较强，机器开始检测，而达到这一荧光强度的循环数即初始循环数。 荧光定量PCR参数解析-- CT值 CT值主要是由反应中模板的初始浓度决定。模板浓度高，只需较少的扩增循环就可累积足够的产物，产生高过背景的荧光信号，那么CT值就会很早出现，相反CT值则会较晚出现。 大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。 CT值在30-35个循环之内出现，需要多次重复试验以判断数据的准确性，然后再判断是否有目的基因的扩增。 CT值在35个循环之后出现，可以认为反应失败。 荧光定量PCR参数解析--融解曲线 融解曲线用来判断产物的特异性 一般认为特异性产物的Tm值应大于80℃ 荧光定量PCR参数解析--标准曲线 相对定量：用标曲来判断反应是否需要优化 绝对定量：用标曲来计算待测样本的量 荧光定量PCR参数解析--扩增效率 r2=0.999 Slope= -3.364 E=10(-1/slope) －1 荧光定量PCR数据分析--扩增效率 扩增效率接近100%是一个荧光定量试验成功与否的最好标志。 荧光定量PCR参数解析--