生物技术制药生物技术药物的开发和质量控制.ppt

生物技术药物的开发和质量控制 药物毒性作用的机制 错误修复 许多药物能改变生物大分子的结构，如果这些大分子未经修复或修复错误，将导致机体高水平的损害 修复可以发生在分子层面、细胞层面和组织层面 修复错误或修复失败导致的毒性 组织坏死：分子损伤不可逆 纤维症：一种以异常组分在细胞外过度沉积为特征的病理状态，主要原因是修复不全。如肝硬化、矽肺等 致癌：DNA修复失败或细胞凋亡失败 生物技术药物的开发和质量控制 生物技术药物的分析检测 电泳分析（electrophoresis analysis） 凝胶色谱分析（gel chromatography analysis） 酶分析法（enzyme assay method） 酶活性测定 底物测定 免疫分析（immunoassay） 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 电泳（首先是一种分离方法） 带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象 利用不同带电粒子在电场中具有不同的迁移率而分离 粒子间的分离程度与电荷性质及分子量有关 利用电泳分析方法测定相对分子质量是一种参比分析法 生物技术药物常用的电泳分析手段 SDS—— 蛋白质类药物 琼脂糖凝胶电泳 —— 核酸类药物 等电聚焦与二维电泳 —— 蛋白质组分析 毛细管电泳 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 SDS蛋白质亚基解离、变性，游离成单独的肽链 用SDS掩蔽蛋白质表面的电荷，使所有肽链均带上相同密度的负电荷，因此肽链在聚丙烯酰胺凝胶中迁移的速率只取决于肽链的相对分子质量 当肽链的相对分子质量在 15,000～200,000 范围内时，其迁移率与其相对分子质量的对数值呈线性关系 用已知相对分子质量的标准蛋白（marker）作为参比，可以测得待测蛋白亚基的相对分子质量 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 SDS分析结果示例（条带经考马斯亮蓝R250染色） 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 琼脂糖凝胶电泳 核酸分离及相对分子质量测定的首选方法 核酸片段在琼脂糖中的迁移率取决于核酸分子大小和形状 核酸片段在琼脂糖凝胶中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比 DNA的构型对迁移率产生很大的影响，迁移率按从大到小依次为：共价闭合环状DNA 线型DNA 开环的双链环状DNA 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 琼脂糖凝胶电泳分析结果示例（在紫外线照射下，条带因含有荧光染色剂而发光） 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 等电聚焦与二维电泳 测定蛋白质的等电点 利用特殊的缓冲液在电场中形成由阳极向阴极逐步增加的 pH梯度，当蛋白质样品加入到这一体系中后，不同的蛋白质即移动并聚焦于与其等电点相当的 pH 值的位置上 分辨率很高，可以区分出 0.01～0.02 pH 单位的蛋白质，并具有浓缩聚集作用，几乎无条带扩散现象 在等电聚焦的基础上朝垂直方向进行 SDS，即得到二维电泳，用于蛋白质组的分析 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 二维电泳图谱示例（银染色） 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 毛细管电泳 以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的分析方法 淌度：单位场强下离子的平均电泳速度 优点：毛细管能有效散热，避免因电流产生的热量导致的区带扩散，因此可以使用高电压，提高了分辨率和灵敏度，加快分析速率 毛细管电泳兼有色谱技术和电泳技术的特点，常用于微量分析和痕量分析 生物技术药物的开发和质量控制 电泳分析法 毛细管电泳 生物技术药物的开发和质量控制 凝胶色谱分析法 测定大分子相对分子质量的一种常用方法，可以测定大分子相对分子质量的分布，尤其是多糖 由于不同的大分子具有不同的空间尺寸，因此它们在凝胶层中移动的路径不同 流动相：分子很小，可以自由出入 体积大的分子：渗入凝胶的大孔，但不能进入小孔，在凝胶内部保留时间短；或者完全无法进入凝胶孔隙而被排斥 体积小的分子：可以渗入大孔和小孔，在凝胶内部保留时间长，不易洗脱 大分子优先于小分子被洗脱 生物技术药物的开发和质量控制 t1 t0 t2 t1 t0 t3 t0 t1 t2 t0 分子量： 生物技术药物的开发和质量控制 酶分析法 酶分析法是利用酶的催化反应进行待测物测定的一类分析方法 酶活通常用一定条件下催化某一化学反应的速率（单位时间内转化的底物量或产物的生成量）来表示，因此通过测定反应中底物的减少量或产物的增加量来测定酶活性 酶活力的测定 —— 药用酶的检测 底物浓度的测定 生物技术药物的开发和质量控制 酶分析法 酶传感器结构 葡萄糖氧化