药用植物组织细胞培养.doc

《药用植物组织细胞培养》 课程实验教学大纲 [适用对象]　环境科学专业 [实验学时]　18学时 一、实验教学任务和目的 本课程是在植物生理学和细胞生物学和遗传学的基础上，结合现代生物技术的基础知识和操作，重点开展药用植物细胞工程的基本技能和操作技术。其内容涉及到细胞器、细胞、组织和器官水平的工程技术和所进行的各类体外操作。 二、实验教学基本要求 要求学生在实验操作上掌握细胞工程技术中的核心，无菌操作技术以及通过一定的实验技巧控制培养的技术。同时，通过实验观察、结果分析使学生初步学会本领域的实验设计、实验分析及其完整实验报告的撰写。通过本课程的学习，使学生掌握中药生物技术的基本理论，更重要的是锻炼学生的实际操作能力，掌握操作过程。 三、实验教学内容 实验一　 MS培养基母液配制 1、实验目的和要求 使学生了解培养基母液的配制目的、方法和注意事项；掌握母液的配制方法和注意事项，为培养基制备作好实验准备。 2、实验内容 (1)按配方表配制MS培养基母液：大量元素配20×，微量元素和其它成分配制成200×，母液贮存于2～4℃ (2) 植物激素配制BA和NAA配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，贮存在2～4℃ 3、实验仪器 电子分析天平(感量0.0001g)(暂缺)、药物天平(感量0.01g)、烧杯(50ml)、量筒(1000ml、100ml、50ml)、容量瓶(200 ml、100 ml、50 ml、25 ml)、细口瓶(1000 ml)。 4、实验学时 6学时 实验二 培养基配制与灭菌 1、实验目的和要求 学习培养基配制与灭菌的方法和注意事项；掌握培养基的配制方法和注意事项，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。 2、实验内容 实验按500ml容量一组配制培养基，保证下一次实验每一学生有5瓶培养基供接种用。愈伤组织诱导培养基：MS＋BA 2mgl-1+NAA mgl-1+ Sucrose 20gL-1+ Agar 7g-1 （1）向容量瓶中顺序加入培养基母液：大量元素 10ml微量元素 5ml铁 盐 5ml其它成分 各5mlBA和NAA 各2.0ml （2）加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入10g蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。（3）加入3.5g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积500ml，继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。用记号笔写上学号或姓名。（4）分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度 121℃，压力1.1kg 3、实验仪器 高压灭菌锅；1000W电炉、三角瓶、棉塞、无菌膜、培养皿、烧杯等。 4、实验学时 6学时 实验三 无菌操作及愈伤组织诱导技术 1、实验目的和要求 学习无菌操作的方法和注意事项；掌握无菌操作技术；基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件。 2、实验内容 （1）实验准备：无菌培养皿每学生2套。 实验课开始前30min. 将实验用具、实验2配制的培养基及无菌叶片，同时用75%酒精擦洗后置于超净工作台，打开超净工作台风机和紫外灯。 （2）操作方法 A. 在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。 B. 点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。 C. 取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种4-5小片。 D. 快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。 E. 接种后的三角瓶置于24℃，条件下黑暗培养一周，然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养直至愈伤组织形成。 （3）记载内容培养基凝固状况；实验操作过程；叶片生长状况、接种外植体大小；每瓶接种数、接种总瓶数。 3、实验仪器 超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。 4、实验学时 6学时 实验四 器官发生与植株再生调控培养 1、实验目的和要求 观察和分析不同光照条件形成的愈伤组织对器官分化的影响，观察和分析愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异；了解器官分化和植株再生的过程，掌握离体培养中的转接技术。 2、实验内容 （1）配制器官分化和愈伤组织诱导培养基。培养基配方：分化培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和0.5mgl-1NAA。 愈伤组织增殖培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和2.0mgl-1NAA。 （2）操作方法 A. 观察实验1愈伤组织诱导结果：统计愈伤组织诱导率；观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异，结合理论学习进行分析。愈伤组织形成率＝