医用生物蛋白胶项目简介.doc

PAGE PAGE 7 医用生物蛋白胶项目简介 山西志成生物技术有限公司 联系：杨先生 一、项目背景 医用生物蛋白胶（BFG），又称纤维蛋白封闭剂、纤维蛋白粘合剂（Fibrin Adhesive）。是一种新型安全、可靠的生物止血材料，广泛运用于各种外科手术，有效起到止血、促愈合、防止粘连等作用，20世纪40年代，以纤维蛋白原粉为原料，进行了组织粘合的早期实验。70年代，随着分离、提纯技术的完善，纤维蛋白胶初步在临床进行了实验性试用。直至80年代，由奥地利Immuno公司将其商品化，在欧洲市场迅速推广。在亚洲，生物纤维蛋白胶也得到医学界人士的青睐，日本多家公司生产了此项产品。我国于80年代初由上海学者研制出由人血提取的医用纤维蛋白粘合剂并进行临床应用，由于人血来源受限，形成商品化有困难。1994年，我国学者以哺乳动物血液作为原料，研制出新一代生物止血材料——纤维蛋白胶。原料来源丰富，经过处理既降低了成本，排除了人体血源性疾病的感染机会，先后有广州倍绣、上海利康瑞、上海松力生物技术有限公司等国内动物血FS以医疗器械形式上市；经国内医学界试用取得良好的效果，为生物止血材料的推广应用提供了条件。本产品由主体胶、主体胶溶解液和催化剂、催化剂溶解液组成。 主胶体纤维蛋白原和凝血酶是从哺乳动物血中提纯，猪血深加工综合利用项目的一个生物高科技产品。 二、技术研究 1、猪血采集和检测????? 猪血采集应在国家定点的规模化屠宰场，并符合中华人民共和国国务院令第525号《生猪屠宰管理条例》的有关要求。为控制采血过程中的污染和保证血液质量，对采血环境应有一定的洁净度要求，同时应采用封闭方式采集于无菌容器中。应固定采集量（即每一容器收集多少头猪的血液）及采集时间（即每一容器的收集时间）。对于已采血的每批生猪，应出据屠宰场的宰后检疫证明；如检疫不合格需对相应批号产品进行处理（提出具体处理措施）。应对采集的混合后血液/血浆进行蛋白量、微生物指标等检测，并建议做有代表性的人畜共患病原的检测（如乙型脑炎病毒、戊型肝炎病毒、猪链球菌等）。2、主胶的制备 猪血浆的预处理：　 新鲜猪血浆于 - 20℃ 纤维蛋白原的分离: 采用冻融法从猪血中提取纤维蛋白原。确定提取条件为:将 抗凝血浆在-20℃ 温度下 冷冻12h,经4℃解冻,低温离心 收集纤维蛋白原样品。,然后加 0.3%TNBP 和 1%Tween-80,24 ℃～26 ℃ 6h 保温灭活病毒 , 样品中纤维蛋白原含量达82.6%,提取率达91.0%,再经分离去除残余的 TNBP及 Tween-80 而得到纯化并经病毒灭活的纤原 ,加适量保护剂澄清和除菌过滤 ,分装冰冻干燥，干热灭活。 ② 凝血酶的分离: a.取冷冻血浆加入血浆体积 8%,12%和 16%的1 mol/L BaCl2溶液,均搅拌20min,压滤,取滤饼分别用pH7.4,0.02mol/L Tris-HCl缓冲液洗涤2次,再分别用pH7.4,0.02 mol/L Tris-HCI400 mL解吸附,3 000 r/min离心20 min,取上清;向上清液中加入固体硫酸铵至 35%饱和度,静置2 h后3 000 r/min离心20 min,上清液中再加入固体硫酸铵至65%饱和度,静置4 h,3 000 r/min离心20 min,沉淀用生理盐水(10 mg/mL)溶解后流水透析过夜。用碱性碘化汞钾试液检测透析内液,待铵离子为阴性后终止透析,收集得凝血酶原溶液。　 b. 凝血酶原的激活 加入 CaCl2至终浓度,于37℃ c.凝血酶粗酶液的制备 　按最佳激活条件(Ca2+0.05 mol/L,37℃,30 min) ,分别将上述制备的溶液激活,用相对分子质量截留量10 000的超滤器超滤。待超滤液中加入0.1 mol/L AgNO3溶液不出现絮状沉淀时停止超滤,收集浓缩液,测定蛋白质浓度、酶活性,计算产量。 d.　凝血酶分离与纯化　将c项由冷冻血浆制备的凝血酶粗酶液上样到用pH5.5,0.01 mol/L醋酸铵缓冲液平衡好的CM-Sepharose Fast Flow离子交换柱,用同样缓冲液洗脱2～3柱体积后,用含0～0.6 mol/L NaCl 的上述缓冲液进行直线梯度洗脱,收集凝血活性组份即为凝血酶精品,测定蛋白质含量和活性。生产过程采用两步病毒灭活，安全可靠，经澄清和除菌过滤分装冻干制成。 3、检测 　 ①ⅩⅢ因子活性测定:用含 0.1%牛纤原和 0.4%的白蛋白的 NaCl2柠檬酸盐缓冲液稀释样品 ,然后用高活性的凝血酶和高岭土悬液使溶液凝固 ,加入 5%单氯乙酸溶液来测定凝块的稳定性 ,用标准血浆代替样品 ,以后一