基因组和基因组学.ppt

构建物理图谱的原因 1）遗传图谱有限的分辨率 对于人类或其他高等生物不可能得到大量的子代群体，减数分裂的后代有限，限制了连锁分析。 2）遗传图谱的精确性不高 染色体上存在重组热点，影响邻近区段的遗传图谱的准确性。 构建物理图谱的三条途径 1）限制性酶切图谱 识别位点较多的内切酶：如NotⅠ，其8个核苷酸出现的频率为1/48=1/65536bp，而识别位点为6个核苷酸的出现频率为1/46=1/4094bp。 其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶： 人类基因组中，5’-CG-3’出现的频率很低： Sma Ⅰ酶切DNA，每78kb只有1个切点。 BssH Ⅱ酶切DNA，每390kb只有1个切点。 Not Ⅰ酶切DNA，每10Mb 只有一个切点。 2）荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization),FISH)：通过荧光标记的探针与DNA分子杂交，杂交信号即探针DNA在染色体上的图谱位点。 步骤：取处于有丝分裂中期的细胞制片，将染色体变性成单链，在将标记的DNA探针变性后杂交到染色体上，保温处理后，显微镜下直接观察。 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH） 3）序列标签位点 利用某一已知序列为标签的位点（sequence tagged sites,STS)作探针，与DNA杂交，绘制物理图谱。 STS的要求： 已知序列，便于PCR检测； 基因组中仅一个位点，无重复。 DNA序列标定部位（seguones tagged site, STS) 重叠克隆群（conting） YAC (yeast artificial chromosome) BAC (bacterial artificial chromosome) 人类部分染色体物理图谱 物理作图是应用分子生物学技术来直接分析DNA分子，从而构建能显示包括基因在内的序列特征的位置图。 限制酶作图是对小的基因组进行物理作图的有效方法。 FISH技术是通过荧光标记显示DNA标记在一条染色体中的位置。 用放射性杂交体组及克隆文库技术进行STS作图，是最有效的物理作图方法。 如某一区域的大小为多少cM可以基本折算为某一区域大小为多少Kb。物理图的绘制需要筛选大量的物理标记以及进行大量复杂和繁琐的分析。 1995年，第一张以称为序列标签位点STS为物理标记的物理图谱问世，它包括了94％的基因组和1500多个标记位点，平均间距为200Kb（这就是所谓的分辨率）。这样，物理图就把人类庞大基因组分成具有界标的1500个小区域。 人类基因组物理图的问世是基因组计划中的一个重要里程碑，被遗传学家誉为20世纪的生命（生物学）周期表。 利用一张遗传图，研究人员可将一种特定的遗传病的遗传模式同标记顺序的遗传模式进行比较，迅速确定引起该遗传病的基因的位置。 然后，计算机把数据固定在物理图框架内。遗传图与物理图结合在一起，就能迅速确定与疾病有联系的基因。 物理图的问世标志着离人类基因组全序列测定仅有一步之遥了。 STS作图 序列标记位点（sequence tagged site, STS）作图是通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中。是目前用于构建最为详尽的大基因组物理图的主流技术。 原理： – STS是一段短的DNA序列，100-500 bp，每个基因组只有一个拷贝。当两个片段含有同一STS时，可确认这两个片段重叠。 – 两个不同的STS出现在同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置，彼此接近，同时出现在同一片段的机会就大，反之则小。 – 两个标记间的图距根据分离频率来计算。 Chromosome Male Female 1.12 1.76 0.78 1.40 0.86 1.30 0.67 1.40 物理图距离（ Mb ）与 遗传学距离 ( cM ) 的对应关系 cM / Mb 制备物理图谱的大容量载体 在制备基因组物理图谱中，需大容量载体。 主要的类型是黏粒： cosmid 粘粒 -- YACs(yeast artificial chromosomes), -- BACs(bacterial artificial chromosomes)和 PACs (phage P1-based artificial chromosomes） 克隆载体： Cosmid（粘粒） YAC（酵母人工染色体） BAC（细菌人工染色体） 人类基