凝胶层析法专题宣讲.ppt

凝胶层析法;凝胶层析（gel chromatography）也称： 分子筛层析 分子排阻层析 凝胶过滤 凝胶色谱等;简介 凝胶色谱是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种技术。 突出优点是：凝胶不带电荷、吸附力弱、不需再生处理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。 ;*; 1、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗???间液体流动相的体积。（用Vo表示） 2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相体积。（用Vi表示） 3、骨架体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（用VGM表示） 4、柱的总体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（用VA表示） 5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（用Ve 表示）;则： Vt=Vo+Vi+Vg ;*;*; 1、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出； 2、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出； 3、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间。 ;也叫凝胶过滤层析;凝胶过滤层析过程示意图; 分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 ;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;交联葡聚糖凝胶的化学结构 ; 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。;*;*;*;*; 1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。 2、稳定工作pH为2－10，强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂。 3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 °C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。 ; 4、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。 5、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。 6、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。 ;*;*; ;（二）葡聚糖凝胶离子交换剂 ;*;*;*;*;*; 在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比可以任意改变。以（T）代表100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。只有在极端pH条件下酰胺键才被水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，故一般只在pH2～11的范围内使用。 ; 像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。 ;*;*;Sepharose;这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在pH 4～9之间，温度0～40℃，超出此范围,可能被破坏。 ;*; 琼脂糖的商品名称有: Sepharose(瑞典) Bio-gel A(美国) Segavac(英国) Gelarose(丹麦)等多种，因生产厂家不同名称各异。; 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。 ; 英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。 ;