荧光定量PCR基础原理课件.ppt

荧光定量PCR基础原理;○PCR扩增的理论模式 ○Real time PCR理论基础 ;PCR是将样本中微量的DNA模版放大来研究模版特性。随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。;由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。 因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。 通过凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。 ;实时荧光定量PCR;PCR扩增的理论模式;PCR分期——“S”形曲线;理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线； 因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。;两种定量方法;两种定量方法;普通PCR技术的检测模式;实时荧光定量PCR的检测模式;实时荧光定量PCR的检测模式;阴性结果曲线图示;阳性结果曲线图示;实时荧光定量PCR基本原理;荧光扩增曲线分三阶段;实时定量PCR的两个重要概念;实时定量PCR的两个重要概念;基线 阈值 Ct值;Ct值∝DNA起始浓度;;定量方法;Real time PCR 化学原理;SYBR?Green?I荧光染料的作用原理 ;退火：产生荧光信号;;染料法优缺点;;荧光共振能量转移（FRET）;TaqMan探针法-水解探针;探针完整时，报告基团发射的荧光信号被近距离的淬灭基团吸收；随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针， 其5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。 ;;TaqMan探针的数量关系;TaqMan探针的优点;Real time PCR优点;定性检测 （A或B？ 有或无？是什么？） 特定病原的检测 疾病的诊断 GMO检测 基因分型（如SNP、耐药性检测） 辨别真伪的检测 定量分析 (有多少？差几倍？） 绝对定量 病原载量的定量 GMO成分的评估 残留DNA的测定 相对定量 基因表达差异的比较 治疗手段的效果评估;