国家自然科学基金申请讲座课件.ppt

综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。 3、参考文献 A、要以英文文献为主，同时也要引用国内同行 知名专家的文献。 B、引言信息要全：文章题目、作者姓名、具体 出处（包括期刊名、年份、卷期、页码等）。 C、主要引用近五年的文献，最好能有04年的最 新文献。 三、研究方案 1、研究目标 撰写要求： 有限目标，与研究内容相呼应 如：探索……问题，明确……关系，揭示……规律， 阐明……原理（机制），建立……方法等 研究目标： 筛选出与老年性白内障相关的基因，明确 部分基因在白内障形成中的作用，从晶状体上 皮变化的角度阐明白内障的发生机理，为防治 白内障提供线索。 2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成； 内容分散，不能集中阐明研究目标。 撰写要求：内容要适当，确保研究周期内完成； 与目标相辅相成，为研究目标服务。 篇幅要适度，注意与技术路线区别。 研究内容： （1）筛选白内障相关基因：采用改良的消减 杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞 和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立 cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用 基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上 皮细胞中筛选出白内障相关基因。 （2）研究白内障相关基因的结构：对白内障 相关基因cDNA进行特异扩增、PCR产物的克隆、 鉴定，测定基因序列，分析基因的结构，获得全长 基因。 （3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞 变化中的作用：利用反转录病毒，对培养的人晶状 体上皮细胞和在体小鼠晶状体进行基因转染，观察 白内障相关基因对晶状体上皮细胞的影响以及在白 内障形成中的作用。 观察指标如下：①存活细胞数；②光镜、透射 电镜下细胞形态的变化；③细胞凋亡检测：用原位 末端标记和连接酶介导PCR方法，从形态和DNA 水平分析细胞凋亡；④细胞增殖的检测：用免疫组 织化学的方法检测核蛋白Ki-67；⑤细胞骨架蛋白 （Vimentin、Actin）的检测：用Northern杂交 法检测vimentin 、actin mRNA的表达，用SDS- PAGE及Western blot方法检测波形纤维蛋白、肌 动蛋白（均为尿素溶性蛋白）；⑥晶状体蛋白的检 测：用SDS方法观察水溶性蛋白α、β、γ 晶状体蛋白的变化。 3、拟解决的关键问题： 存在问题：抓不住关键问题或抓得不准。 什么是关键问题 ？ --研究过程中对达预期目标有重要影响的 某些研究内容或因素。 --为达预期目标所必须掌握的关键技术或 研究手段。 撰写要求：找出关键问题，写出解决办法。 拟解决的关键问题： （1）建立差异表达的cDNA文库： 建立差异cDNA文库是筛选老年性白内障相关基因的前提。 为使差异cDNA文库具有代表性，我们采取以下解决方案： ①选择各种类型老年性白内障晶状体的前囊膜、取足够 大量的标本（拟取50例标本）作为建库的mRNA的来源。 ②利用改良的消减杂交技术可快速、有效地获得差异表 达的完整cDNA片段。此技术是本课题组成员主要的研究成果，在应用此项技术中已积累了较丰富的实验经验。 （2）制备基因芯片： 制备用于本研究的芯片是筛选老年性白内障相 关