前列腺癌方面免疫组化基础知识课件.ppt

前列腺癌方面免疫组化基础知识;;PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮内瘤，均呈阳性表达，定位于上皮细胞的胞质中，而在前列腺转移癌则呈阴性表达，因此PAS阳性提示肿瘤来自前列腺上皮，可用于区分前列腺癌与前列腺转移癌[5]。PSA在前列腺良、恶性病变中均呈阳性表达，故PSA不能用于鉴别良恶性病变。几乎所有的前列腺癌（除了分化最差的癌和少数激素治疗后复发的进展期癌以外）PSA标记都阳性，而高分化前列腺癌的PSA表达强于低分化前列腺癌, 表明PSA表达与分化程度有关。而对于分化很差的癌，即使PSA阴性也不能完全排除前列腺癌，还要结合其他检查综合考虑。偶尔PAS阳性可出现在前列腺以外的组织和肿瘤，但一般为局灶性弱阳性 [6]。;;CK34βEl2;在正常和良性增生以及上皮内瘤的前列腺腺体，导管周围形成连续或断续的CK34βE12分布。而前列腺癌的腺体的基底细胞层完全消失，所以最终表现为CK34βE12不表达。但CK34βE12标记基底细胞可部分阴性，对经尿道电切的标本，常因标本经人为烧灼而受影响，因此可靠性和稳定性欠佳。有20%～30%的前列腺癌导管腺癌和筛状癌周围有连续或间断的基底细胞，而部分良性前列腺病变,如腺病和不完全性萎缩的腺泡周围基底细胞可部分甚至完全消失。说明基底细胞消失并非诊断前列腺癌的绝对指标。而免疫组化操作不当，则有可能出现假阴性结果而误诊。故免疫组化结果应结合HE切片中的其他形态学特征综合判断。;P63;;;α-甲基-辅酶A-消旋酶 (P504s);;;;免疫酶细胞化学实验技术---实用免疫细胞与核酸技术（周德山）;;第一节　固定和切片;;1．AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene ）法　　 是改良的冰冻置换法（freeze substitution）的简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986)报告，该法具有同新鲜（未固定）组织冰冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），组织细胞内水份逐渐被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20℃丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮过夜。实际上组织在4℃丙酮内过夜亦可得到同样效果。如在该固定液内加入少量蛋白酶活性阻断剂，并采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色结果。;微波固定（Microwave fixation）　　;二、切片;;第二节　染色方法;;;;（二）本科标抗体的制备（Boosma,DM, 1983）;（四）染色原理及步骤;2．染色程序;;（6）PBS漂 洗2min（共两次），移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%Triton X-100)中5min（室温）。Tween-20为一种表面活性剂，除具有清洁作用外，还可增加组织的通透性，有利于组织细胞内抗原的显示。 （7）4%Block Ace或0.1%～1%BSA湿盒内孵育15～25min（室温），然后；轻轻弃去孵育液（不冲洗）；以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色。 （8）根据需要，可用1/5～1/30正常来活兔/羊血清孵育15～20min（室温，以酶标抗体相同种属正常血清为宜，最好是同一动物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀释酶标抗体时，加入1%～2%的同一种属正常血清。;9）轻轻弃去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀释的第一抗体（抗体用量：每张切片一般为50～80μl），湿盒内孵育1～2h（20～25℃）；免疫电镜用标本，4℃过夜。 （10）PBS充分冲洗（3次×2min），以去除切片上非特异吸附的抗体。应用不同的第一抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。 （11）经0.05%Tween-20/PBs 2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀释的HRP酶标记的第二抗体,湿盒内孵育45～60min(20～25℃)。;;（14）呈色：HRP标记抗体的呈色液为0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片经PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液内10～15min（室温、暗处），亦可镜下控制显色速度。终产物为棕褐色沉淀。用于电镜观察的标本，呈色3～5min即可，防止DAB终产物向周围扩散，影响超微结构定位。另外，显色液应于用前新鲜配制，避免DAB本身氧化变质。新配制的DAB为无色透明液体。若DAB液已氧化变为紫红色，应换新药重新配制。 （15）将切片置流水中（仅光镜观察）或PBS（电镜标本）内，终止呈色反应。 （16）未固定的冰冻切片，可用1%戊二醛-PBS液加强固定5～1