构建胰岛素基因工程菌课件.ppt

Current Protocols in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc. Chapter 1 Escherichia coli, Plasmids, and Bacteriophages Section II Vectors Derived from Plasmids Unit 1.5 Introduction to Plasmid Biology Figure 1.5.11 * * 构建胰岛素基因工程菌 前言： 胰岛素的发现 胰岛素的结构 重组人胰岛素及类型 重组人胰岛素基因工程菌的构建： Construction of the ecotin(大肠杆菌素)–proinsulin expression plasmid Construction of pEGP1 plasmid 胰岛素的发现 1922 Frederick Banting Charles Best 人胰岛素一级结构 CHAIN A: 21 amino acids CHAIN B: 30 amino acids 胰岛素立体结构 1 翻译后不需要糖基化修饰，在细菌内合成的胰岛素具有完整的生物活性。 2 胰岛素是一个相对较小的分子，由两条多肽链组成，一条含21个氨基酸（A链）和另一条含30个氨基酸（B链）。 胰岛素具有两个利于通过DNA重组技术生产的特点： 重组人胰岛素 1982年10月在美国上市，全球第一 个商业化基因重组人胰岛素。 1.Humulin （优泌林） 2.Novolin （诺和灵） Eli Lilly and Company Novo Nordisk 欧洲市场的重组胰岛素类似物 重组人胰岛素类型 1.重组前胰岛素 Chain B Chain C Chain A 2.A,B链分开表达 + Chain B Chain A 3.B-miniC-A 重组表达 Chain B Chain A Mini Chain C 4.B-XXX-A 重组表达 X为氨基酸 Chain B Chain A X1X2Xn N≤3 重组人胰岛素基因工程菌的构建 重组前胰岛素 Chain B Chain C Chain A 人胰岛素原表达法 基因工程菌的构建战略： tac b-Gal C peptide ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 人胰岛素原的cDNA 重组人胰岛素原 转化 分离纯化 人胰岛素原表达法 表达产物的后处理路线： S S S S C N 胰蛋白酶 C peptide A peptide B peptide M R R K R CNBr R S S S S C N N C S S S S R 羧肽酶B B链中第22位上的Arg和第29 位上的Lys由于良好折叠的原 因，对胰蛋白酶不敏感 人胰岛素原表达法 获取人胰岛素cDNA，克隆在含有Ptac和?-gal基因的表达型载体上，两基因通过Met的密码子连接 通过CNBr裂解法回收胰岛素原蛋白 体外折叠 胰蛋白酶 去除C链，余下完整的A链和C末端带一Arg的B链 羧肽酶 获得人胰岛素 结果：由于有C链的存在，胰岛素原在体外能形成天然的空间构象，使得正确折叠率达80％，成本为$50/g Materials 1.Restriction enzymes from NEB and MBI Fermentas 2.PCR purification and gel extraction kits from Qiagen 3.pCR-Blunt II-TOPO kit and from Invitrogen Top10 competent cells 4.E. Coli BL21(DE3)Gold from Stratagene 5.E. coli GM2163 (dam- and dcm- )