岩洞珊瑚伴生菌表4.ppt

Oculina patagonica珊瑚伴生菌生物系 赵闯营 实验材料与方法 样品采集 样品采集点Sedot Yam，位于地中海水域以色列海岸。其中三个白化的珊瑚碎片于2005年9月份采集，另两个则于2006年1月岩洞中采集。岩洞中采集的样品深度在1-3m，两采集点间距小于3m.样品采集后立即放入水中的塑料袋中带回实验室。 黏液的提取 将珊瑚破碎为2×2cm碎片后装入50ml离心管，2675g状态下离心3min，液体即为珊瑚黏液。离心后的碎片加入人工海水研磨，放置15min后，取漂浮物即为珊瑚组织。 * * 摘要 通过分析从克隆文库和独立菌落中提取的16S rRNA基因，可以判定从白化的地中海Oculina patagonica珊瑚和岩洞生长的O. patagonica珊瑚组织和黏液中细菌的相对丰度。得出的结果也与先前发表的正常O. patagonica珊瑚的数据进行了比对。白化的、岩洞生长的、正常的珊瑚中细菌的菌落彼此完全不同。以序列相似性99.5%标准表明，白化的珊瑚菌中316个克隆序列中的25%与不动杆菌属完全一致（100% identity)。岩洞生长的珊瑚菌中97个克隆序列的29%与从一种大珊瑚礁中提取的一种不可培养细菌有98%一致性。正常珊瑚优势菌则是灿烂弧菌。对珊瑚中分离的细菌用SYBR染色后表明，可培养细菌仅占总细菌的0.1-1%。从白化珊瑚、岩洞珊瑚和正常珊瑚中分离的能大量培养的细菌分别与Microbulbifer sp.、之前从正常珊瑚中分离的一种α-变形菌和一种α-原生菌序列最为接近。通过对O. patagonica珊瑚的研究我们得出以下三个结论： 1 珊瑚组织中细菌数量多与黏液 2 珊瑚组织中细菌种类与黏液中不同 3 由白化或缺少光照引起的无虫藻素共生的珊瑚伴生菌的种类与数量与正常相比会发生显 著改变 引言 对Oculina patagonica珊瑚白化和生态效应的研究已相当普遍。首次发现O.patagonica珊瑚是在1996年的地中海。目前，这种珊瑚在数万里的地中海水域栖息繁殖。除了在潮水坑，砂岩，暗礁栖息外，在无虫藻素生长的黑暗的岩洞中也能发现它们。 每年夏天都会发生O. patatonica 珊瑚的白化，从春末开始到海水温度达到30０C 的9月份达到高峰，9月中将有约90%的珊瑚白化。但这些珊瑚会在秋天和冬天恢复。在1995年研究报告声称，珊瑚白化是由shiloi 弧菌引起。从95年到2002年，对温度与珊瑚白化的关系也进行了大量研究。然而，2002年以来珊瑚开始对shiloi 弧菌产生抗性，无论在正常还是在白化的珊瑚中均无shiloi 弧菌存在。近来，攻毒实验表明，shiloi 弧菌先黏附与珊瑚表面，渗透进入珊瑚外胚层后被杀死。 实验表明虫藻素光合作用的产物是珊瑚营养的重要来源。越来越多的数据表明，与珊瑚伴生的细菌在正常和病态珊瑚中起重要角色作用。珊瑚与这些微生物存在着共生关系。珊瑚前生命期假说认为：当外界环境发生诸如，温度上升、微生物种类发生大的改变等情况时，珊瑚就会发生异变。本实验将对这一理论中的—当珊瑚遇到胁迫时体内细菌种群会发生改变这一假设进行验证。这种胁迫是由珊瑚白化引起的无虫藻素共生。得出的数据还将与由缺少光照引起的无虫藻素共生和正常珊瑚伴生菌进行比对。 细菌的分离及计数 用提前准备的0.2um滤过的海水对珊瑚黏液和组织进行十倍连续稀释后，涂布于Marine Agar 2216 和TCBS两种培养基制备的平板上。涂平板后300C培养一周。对最高稀释倍数的菌落进行DNA分离。所有平板的细菌用SYBR Gold法进行计数。每个样品最少扫描10次 . DNA提取和16SrRNA基因的PCR 珊瑚的黏液和组织9300g离心15分钟，沉淀用 UltraClean Soil DNA Kit 提取DNA.对可培养细菌的DNA可用GenElute? Bacterial Genomic DNA Kit 进行提取。进行PCR时，从菌落基因组中、海水中、珊瑚黏液样品中、珊瑚组织样品中提取的16SrRNA基因均用8F 和1492R引物。50-μl reaction（5 μl 10× buffer, 1 μl 2.5 mM total dNTP mixture, 5 μM　of each primer, 10 ng template DNA, and 2.5 units Ex Taq　DNA polymerase ） 解链：９５０C　３min 循环：９４０C　１min 55０C 1min 72０C 1min　（３０cycles） 复性