酵母双杂交操作步骤.docVIP

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖 20g (即2%) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（过滤即可使用） 酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（大约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。 YPD培养基(1000 ml) 20 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母提取物 20 g/L 琼脂（只有制作平板才用） 20 g/L 葡萄糖 (即2%) 1x YPDA培养基(1000 ml) 20 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母提取物 0.03 g/L 腺嘌呤 （即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温 20 g/L 葡萄糖 (即2%) 实际配制的方法是： 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用） 配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压） （蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，121℃高压15min。 注意： 高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。 可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。 需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。（kanamycin可以20℃贮存一个月，加入到平板中去可以4℃贮存一个月。） PEG/LiAc溶液（即配即用） 用下列贮存液来配制 50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。 最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例） 终浓度 为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质 PEG 4000 40%