第十四讲 蛋白芯片和组织芯片.ppt

蛋白芯片和组织芯片 第十四讲 蛋白质组学(proteomics) 以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象 蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。 蛋白芯片 蛋白芯片是微缩化的如ELISA的免疫检测方法 跟DNA芯片类似，蛋白芯片是把抗原、抗体、多肽样本高密度地点制在芯片上，使多种样本能同时得到检测 可借用DNA芯片产业的成熟经验，如点样仪，扫描仪，图像处理，蛋白芯片的制备以蛋白共价结合在玻片上为主，便于快速和自动处理 提高了蛋白质鉴定的速度与重复性，在蛋白质的生物活性以及大分子与蛋白质之间相互作用等方面展示了独有的魅力 蛋白芯片的操作流程 点样样品的准备：蛋白的纯化，并将蛋白溶解于点样液中 点样 点样后：洗涤洗去未结合的蛋白质 蛋白芯片的封闭（blocking） 将待检的蛋白样品或小的分析物加入到蛋白芯片上；加入蛋白质样品与芯片进行抗原抗体反应 洗涤、检测 在上述各步中要特别注意降低非特异的结合，同时增强检测的灵敏度和精确度 芯片制备 芯片制备的方法包括机器人接触式点样、压电喷墨点样。这与DNA芯片相似。 为达到蛋白质组学分析中揭示蛋白表达特征（包括蛋白质修饰）、蛋白质相互作用、蛋白质的功能等目的，要将蛋白质固定在固相支持物的表面，并保持其原有的折叠构相（functional protein activity）及生物学功能，所以在固定及之后的操作中要保持蛋白质的水合状态以防止变性。 玻片由于具有廉价、表面光滑、低荧光背景及性能稳定等优点，已经被广泛应用于蛋白质微阵列的制作 蛋白质一般要在点样液中加入含甘油、BSA的磷酸盐缓冲液中，以防止微滴的蒸发。 制作芯片的表面基质 和良好的DNA芯片表面一样，良好的蛋白质芯片基质表面应该适合不同的化学处理。 能获得良好的，形态一致的样点 尽量降低非特异结合 应考虑到不同蛋白不同的理化性质，如极性、疏水性、电荷和结构，蛋白芯片应能使点在芯片上的不同种类的蛋白能与待检的其他蛋白或配基结合 根据蛋白芯片用途的不同，使用不同的蛋白固定方法。一般的蛋白固定方法包括：被动吸附、共价偶联、亲和结合 聚赖氨酸修饰玻片虽然不是通过共价键固定蛋白质的，但由于聚赖氨酸修饰玻片广泛地作为基因芯片的载体，且制作简单，具有较高的信躁比以及较均一的点样形态等优点，仍有许多蛋白质微阵以聚赖氨酸修饰玻片作为载体。 Angenendt等通过比较多种载体以及其表面修饰方法发现，聚赖氨酸修饰的玻片上点样点的形态比较均一，点间变异系数(11%)小于其他载体。但是聚赖氨酸修饰玻片同其他二维载体表面一样，敏感度不佳，最低检测限较高。 Haab等报道了用聚赖氨酸修饰的玻片为载体的抗体微阵列来研究抗原抗体的相互作用，但在玻片表面固定抗体时拖尾现象很明显，而且在点的内部抗体的分布也是不均匀的，影响结果的正确性和精确性。 被动吸附表面介质 聚苯乙烯塑料表面（polystyrene plastic surface） 聚丙烯酰胺凝胶（3-dimensional polyacrylamide gel）是一种三维表面的介质，与二维表面相比，可以提供更高的灵敏度、动态范围和天然构想。它是基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。丙烯酰胺凝胶聚合后，可以将成型的胶置于载玻片表面，Miller等人将184个抗体点样到水凝胶包被的载玻片和多聚L赖氨酸包被的载玻片上(with a cross-linking layer) ，水凝胶表面的的信噪比更高。 被动吸附适于进行灵敏的蛋白质表达及抗体特异性的筛选，但是由于蛋白是随机吸附到介质表面的，蛋白会有部分的变性，无法进行定量分析，蛋白结合到基质上的方向也很难控制。不同蛋白质的吸附能力不同，信躁比也较低。 由于某些吸附能力较弱，洗脱过程中一些蛋白质有可能脱落。由于蛋白质在基质表面固定的部位及方向不同，其生物活性将有所差别，使实验的重复性不好。 共价交联covalent coupling 大部分蛋白质芯片的制备方法都依赖通过蛋白质表面的氨基或巯基与活化的介质（通常为玻片）表面随机的共价交联。 MacBeath和Schreiber使用乙醛aldehydes 、甲硅烷处理载玻片，然后将蛋白质点样到处理过的玻片上。乙醛与蛋白N端α氨基或蛋白质表面赖氨酸反应形成Schiff碱，这样可以使蛋白以几个特定方向与芯片表面连接，以便蛋白可以用不同的表面与其它蛋白或小分子反应。他们用这种方法成功地检测了蛋白－蛋白反应，分离出蛋白激酶的底物。 醛基修饰玻片 醛基修饰玻片也是在DNA微阵列中广泛应用的载体，现在这一方法在蛋白质微阵列中得到了应用。该方法通过醛基和蛋白质上的氨基形成Schiff碱而把蛋白质共价固定