蛋白质结合相互作用及研究方法.ppt

蛋白质相互作用及研究方法; * DNA * RNA * Protein ; 已有超过1000个物种的基因组完成测序，大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 ;蛋白质序列特点和结构 蛋白质进化过程和保守序列 蛋白在细胞内的定位??其相关联的细胞器 蛋白质表达谱 蛋白质翻译后修饰情况 了解与其相关联的其他细胞蛋白质;蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 ;Human protein-protein interaction (PPI) network; 错误的蛋白质相互作用可能导致疾病 如 Alzheimer’s disease, beta-淀粉样结构的堆积（alpha-synuclein与synphilin-1结合）； Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions. Nat Genet. 1999;22(1):110-4 如尤文氏肉瘤融合蛋白（EWS-FLI1）可黏附于另一个RNA解旋A蛋白（RHA）控制基因转录。 A small molecule blocking oncogenic protein EWS-FLI1 interaction with RNA helicase A inhibits growth of Ewings sarcoma. Nat Med. 2009;15(7):750-6. ;蛋白质相互作用分析研究思路;等离子表面共振技术 SPR; Two-hybrid system 是90年代初发展起来的新方法。在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。; ;酵母双杂交系统的原理;诱饵蛋白（bait）BD-X 与BD融合的蛋白表达载 体，其表达的蛋白 ; 基因组中GAL4基因是缺失型的 基因组也不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP （因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长）;;培养基类型;酵母双杂交实验过程;; ; ; ; 用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。 绘制蛋白???相互作用系统图谱 (PPI) 在药物设计中的应用;1）发现新的蛋白质与蛋白质的新功能;2）构建基因组蛋白连锁图 （Genome Protein-protein Interaction Map，PPI）;Genome protein-protein Interaction map;3）筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响　　;酵母双杂交系统的优点;酵母双杂交系统的优点;酵母双杂交系统中常见问题;假阳性定义 在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。;排除假阳性的措施;酵母转化效率较细菌低4个数量级，转化成为双杂交技术的瓶颈。 办法：引进酵母接合型 a接合型和?接合型（两者之间可，但自身不能形成二倍体）;菌落筛选;（三）阴性干扰; 酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的应用， 但仍存在一些局限性。 双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。; 在酵母双杂交的基础上，又发展： 酵母单杂交—分析DNA和文库蛋白之间的作用 酵母三杂交--分析蛋白和RNA间的相互作用 酵母的反向杂交--两种蛋白相互作用的结构和位点。;酵母单杂交系统;酵母单杂交系统应用 ;酵母三杂交系统; 反向酵母双杂交系统（ reverse yeast two-hybrid system ）;-Ura;反向酵母双杂交系统的应用;细菌双杂交： 操作简单，周期短2-3天 可研究膜蛋白或跨膜蛋白相互作用