Cas9技术敲除拟南芥IAA2基因.pdf

选 Hereditas(Beijing)2016年8月，38(8)：756--764 WWW．chinagene．ca 研究报告 快速构建多重sgRNA载体利用CRISPR／Cas9技术敲除 拟南芥IAA2基因 刘丁源，邱婷 ，丁晓辉，李苗苗，朱睦元，王君晖 浙江大学生命科学学院，杭州 310058 摘要： doleAceticAcid2)是拟南芥Aux／IAA生长素响应基因大家族中的一员，目前还没有它的突变体的报道， 阻碍 了对其功能和作用机制的深入研究。在CRISPR／Cas9基因组编辑技术中，1个 sgRNA只能靶向基因的1个位点， 有时基因敲除的效率并不高。为了提高敲除效率，本文在 Golden—Gate克隆技术的基础上，通过两轮PCR扩增，将 每3个 sgRNA串联到同1个入门载体 中，再将2~11载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。 结果表明，设计的6个 sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变。与 单个 sgRNA相比，多重sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多；与其他构建多重sgRNA载体的方法相 比，本方法 具有快速、高效等优点。本文所得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供 了良好的材料。 关键词：CRISPR／Cas9；多重 sgRNA串联；基因组编辑；]AA2基因 RapidconstructionofmultiplesgRNA vectorsandknockoutofthe ArabidopsisIAA2geneusingtheCRISPR／Cas9genomicediting technology DingyuanLiu，TingQiu，XiaohuiDing，MiaomiaoLi，MuyuanZhu，JunhuiWang CollegeofLifeSciences，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China Abstract：lAA2isamemberoftheAux／IAAauxinresponsivegenefamilyinArabidopsisthaliana．Noiaa2mutant hasbeenreporteduntilnow,thushinderingitsfurthermechanisticinvestigations．Thenormalgenomiceditingtechnology ofCRISPR／Cas9(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsC／RISPR—associatedprotein9)usesonlyasin· gleguideRNA(sgRNA)totargetonesiteinaspecificgene，andthegeneknockoutefficiencyisnothigh，Instead，multiple sgRNAscantargetmultiplesites；therefore，theefficiencymaybeimproved．Inthepresentinvestigation，weusedthegol- den-gatecloningstrategyandtworoundsofPCR reactionstocombinethreesgRNAsinthesameentryvector．Thefinal expressionvectorwasobtainedbyLR reactionswiththedestinationvectorcontainingtheCas9expressioncassette．Four outofthesixsgRNAswereeffective，andwealsoobtainedalotofinsertionanddeletionmutations．Comparedwithone sgRNA approach，multiplesgRNAsdisplayedhighergene—knockoutefficiencyandproducedmoregemr —linemutants．Thus， 收稿 日期：2016--01-04；修回 日期：2016-02-16 基金项 目：国家 自然科学基金项目(编号和浙江省科技计划项 目(编号：2012C12902)资助[SuppoaedbytheNationalNatur