碱性磷酸酶Km值的(2).ppt

第三节碱性磷酸酶Km值的测定 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶(简称ALP或AKP)是广泛分布于人体肝脏，骨骼，肠，肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶,碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。 一般的成人的碱性磷酸酶正常值为32-92U/L。 酶比活性定义 国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。 因而，必须测定蛋白质毫克数和每毫升样品中酶活性的单位数。 酶活性单位——在37度下保温15分钟产生1ug酚，为一个酶活性单位。 酶促反应动力学 研究酶促反应速率及影响因素 底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂 ※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。 [S] V 底物浓度对反应速率的影响 [S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant) Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ 米曼式方程 解释酶促反应中底物浓度和反应速率关系的最合理的学说是中间产物学说。1913年Michaelis和Menten提出米曼式方程。 Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。 Km Km＝[S] 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 双倒数作图法 Vmax[S] Km+[S] V = （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 两边同取倒数 Ｋm值与Ｖmax值的测定 比色法——呈色原理 p77 省去“酚含量标准曲线的制备” 1/v=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax v=C×V/t C=A/kl 1/A=V/(klT)*(Km/Vmax*1/[s]+1/Vmax) 令1/A=0 （横截率），可得：1/Km=-1/[S] 与k、L无关。 注意事项 1 底物和酶取样准确 2 保温时间准确 1 2 3 4 5 6 7 加入酶的时间 加入碱性溶液 终止反应的 时间 9:00:00 9:00:30 9:01:30 9:02:00 9:02:30 9:03:00 9:01:00 9:15:00 9:15:30 9:16:00 9:16:30 9:17:00 9:17:30 9:18:00 保证每个试管的反应时间为15分钟 实验报告 1 绘制矩形双曲线图 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值 注意事项 1 做如下表格 2 可电脑作图 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数(1/2,1/16) 4 实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终必须得出结论：Km值等于多少 1 2 3 4 5 6 7 Abs [S] 1/ABS 1/[S]