蛋白系列实验指导.doc

PAGE PAGE 3 植物淀粉酶活性的测定 一、目的：植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。 二、原理：由于淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可将3，5-二硝基水杨酸还原成3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以单位时间产生麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。 三、主要实验材料、仪器和试剂 1．实验材料：萌发的小麦（芽长1cm左右）。 2．试剂：（1）l％淀粉溶液（2）0.4 M NaOH （3）pH5.6柠檬酸缓冲液（4）3，5一二硝基水杨酸（5）麦芽糖标准液 四、操作步骤 1．酶液的提取 称取5g萌发的小麦种子（芽长 1cm左右），放入研钵中加1g石英砂，磨成匀浆倒入 50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混合均匀后在室温下放置，每隔5min振荡一次，放置15～20min后，3 500～4 000 rpm离心10min，取上清液备用。（注意此处一定留出9mL，用于酶活性测定！） 2.（NH4）2S04分级沉淀粗纯化 准确计量酶粗提液体积，在搅拌下慢慢加入（NH4）2S04到30％饱和度，静置20min，同上离心。取上清液，量好体积后再加（NH4）2S04 到70％饱和度，静置20min后同上离心，收集沉淀。将沉淀溶于少量洗脱液中，装入透析袋透析过夜。 2．淀粉酶活性的测定 取1步中所提取制备的酶液5mL，放入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释到100mL。混合均匀后，取4支试管，2支为对照，2支为测定管，各加入稀释之酶液1mL及1mL pH5.6柠檬酸缓冲液。 向对照管中加入4mL 0.4M氢氧化钠，以钝化酶的活性。 将测定管和对照管置40℃（±0．5℃）恒温水浴中保温15min，再向各管分别加人40℃下预热的淀粉溶液2mL，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温10min后取出，向各测定管迅速加人4mL 0.4M氢氧化钠，以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。 3. 麦芽糖的测定 （1）标准曲线的制作 取 20mL刻度试管 7只，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg／mL）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0mL，然后用吸管向各管中加蒸馏水使溶液达2mL，再各加3，5-二硝基水杨酸试剂2mL，将各管摇匀，置沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，混合均匀，用分光光度计于520nm波长下进行比色，记录光密度值（OD520），以光密度值（OD520）为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标绘制标准曲线。 表1 麦芽糖标准曲线的制作 管 号 1mg/mL麦芽糖标准液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 光密度值 （OD520nm） 0 0.0 2.0 2.0 1 0.2 1.8 2.0 2 0.6 1.4 2.0 3 1.0 1.0 2.0 4 1.4 0.6 2.0 5 1.8 0.2 2.0 6 2.0 0.0 2.0 （2）样品的测定 取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2mL，分别放入20mL具塞刻度试管中．再加2mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，将各管摇匀，置沸水浴中准确煮沸 5min，取出冷却至室温，再用蒸馏水定容至20mL，混合均匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录光密度值（OD520），从表芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量（mg），然后进行结果计算。 4、结果计算 淀粉酶总活性（麦芽糖mg／鲜重g／5min）= (B－B1)×样品稀释总体积(mL) 样品重（g）× C B：在标准曲线上查得的淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量(mg)； B1：在标准曲线上查得的淀粉酶的对照管中麦芽糖量(mg)； C：比色时所用样品液毫升数。 淀粉酶的纯化——凝胶层析 一、实验目的：学习凝胶层析的基本原理，掌握凝胶层析的操作方法。 二、实验原理：凝胶层析也叫分子筛层析或凝胶过滤，它是以多孔性凝胶材料为固定相，按分子大小不同而分离样品中各个组分的液相层析方法。分子量大于凝胶孔径的分子无法进入凝胶颗粒网状结构内部，它会从凝胶颗粒的间隙里通过，而分子量小的分子会进入凝胶颗粒网状结构内部，因此通过凝胶时比大分子走的路径要长，受到凝胶的阻力大，因此小分子流出速度慢，大分子流出速度快，从而将分子量大小不同的物质分开。 葡聚糖凝胶是指由天然高分子葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。使用最广泛的就是由Pharmacia Biotech生产的Sephadex G系列。根据交联度的不同，Sephadex G有一系列产品，其型号主要有Sephadex G-10，G-25, G-50, G-75, G-100, G150和G-