基于核酸的检测方法.doc

6．基于核酸的检测方法 和基于抗体与致病因子蛋白质表面之间专一性互作的血清学检测技术不一样，分子生物学检测方法检测的是核酸。 一切基于核酸的检测方法（NAB）都是建立在互补核酸链之间的专一性结合，鸟嘌呤与胞嘧啶以及腺嘌呤与胸腺嘧啶这些碱基之间的氢键把核酸链结合起来。加热或高pH的环境可以破坏双链DNA分子之间的氢键，这样两条链就分开了，也就是，双链DNA发生变性。一旦移去热源或中和极端pH，DNA分子的两条单链就会重新结合或复性成双链DNA构型。当不同来源的互补链发生结合，则称之为杂交。在特定的环境下，后一种形式的结合可以在体外进行，从而可以用核酸杂交来检测专一性核酸序列。在聚合酶链反应中，两条单链DNA分子也可以在体外发生互补结合，但是仅在短DNA链（寡核苷酸）和靶DNA（也称退火）之间。设计两个此类寡核苷酸，也就是引物，从而和它们在DNA链上的专一性结合位点发生退火，从而标明靶DNA片段的起点与末尾。于是，拿酶来合成DNA片段的互补性拷贝就成为了可能。 在基于核酸的检测方法中，NAH和PCR最常用于植物病毒和类病毒的诊断。在20世纪80年代早期，NAH首先被用于此类诊断，但是，自从20世纪80年代中期发明聚合酶链反应之后，该方法就成为检测和鉴定植物病毒以及类病毒最常用的分子生物学工具。 这两种方法在检测专一性方面都很棒，相对于血清学或生物学方法而言，PCR的灵敏度就太高了。 表6.1中列出了本章所使用的专一术语以及其缩写形式和释义。 6．1 核酸杂交 在20世纪70年代，病毒RNA互补DNA的合成成为了现实。互补DNA（拷贝DNA或cDNA）可以识别对应的病毒RNA，然后与之发生杂交。和血清学检测的方式一样，这种专一性的结合能力也使其用于病毒的检测和诊断。通过重组DNA技术以及在细菌中克隆或PCR，可以大批量生产和病毒或类病毒RNA互补的DNA或RNA探针。插入32P这样的放射性元素就使得早期制备的诊断性探针具备了放射性，接下来就可以在X射线胶片上观察结果。但是，使用生物素或地高辛这样的非放射性报道分子标记核酸探针，接下来使用免疫检测以及化学发光或比色仪观察，在灵敏度方面和使用放射性探针一样。 起初，‘杂交’被用来描述DNA-RNA杂交，但是，时至今日，杂交包括DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA复合物。 用于病毒/类病毒检测的分子杂交有三类： 溶液杂交，在整个杂交过程中，探针和靶位于溶液中，该杂交最常用于基础研究中（Hull，1993，2002），尽管在某些技术中，利用溶液杂交来实现无凝胶分析PCR产物。 滤纸杂交，在杂交之前把靶固定在滤纸上，是最常见的技术，在随后的章节中将就其进行探讨。 使用原位杂交可以直接从保存的细胞或组织中检测出专一核酸序列。 在滤纸杂交或斑点杂交（也被称为核酸点杂交（NASH））中，靶核酸被固定在硝酸纤维板或尼龙膜（优先使用）上，然后再和标记过的专一性核酸探针发生杂交。该项技术需要一些实验设施和技术人员，因此不太适合作为种子健康检测试验室的常规方法。但是，一旦和专门实验室建立合作关系，可以把植物或种子提取物粗提或纯化后的汁液滴在硝酸纤维膜上或者把组织印在硝酸纤维膜上（此处理和DIBA或TBIA第一步一样）。待硝酸纤维膜干了之后，把膜送到此类实验室中，与标记过的DNA或RNA专一性探针发生杂交，从而完成检测。此种‘远程’检测在某些地方确实行之有效。 此种检测的灵敏度和ELISA一样，但在专一性方面则要更高一些。使用血清学检测时，涉及到的病毒基因组信息只有那么百分之几，然而核酸杂交使用到的病毒核酸信息则要多得多。对于类病毒而言，由于它缺少蛋白质外壳，NAH就成为检测方法之一。 有关NAH的原理和技术方面的细节可以从诸如Hull(1993，2002)和Singh和Nie（2002）中找到。 6．1．1 核酸点杂交测试的一般原理和组成 总体上来说，NAH的原理和以上提到的三类测试完全一样。接下来，我们将就NASH的原理进行探讨。该测试包括以下步骤：制备探针，制备样品（提取核酸），样品变性以及固定在膜上，预杂交和杂交，洗膜以及检测杂交探针。 在这里所探讨的是使用最广泛的NASH。该测试使用地高辛作为报道分子，对杂交探针进行血清学检测，然后通过比色或化学发光观察测试结果。在本节中，我们也就诸如组织印迹（TP）NAH这样没有用到核酸提取的杂交测试进行了探讨。 探针 DNA或RNA探针是核酸，通常由靶核酸转录而得，对于绝大多数的植物病毒和所有的类病毒而言，靶核酸是正义单链RNA（ssRNA）。正常来讲，克隆或PCR可以生产大量的探针，细节请见Hull（1993）以及Sambrook和Russell（2001）。NAH探针必须用杂交后可检