分子生物学7核酸分子杂交.ppt

核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization） 是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 杂交双方分别称为探针与待测核酸。 杂交分子：杂交后形成的异源双链分子 核酸分子杂交技术 是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。 是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测DNA或RNA序列片段的有力工具。 第一节 核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。 一、变性（denaturation） 2．变性的因素： 加热、酸、碱、某些理化试剂（如尿素、甲酰胺） 增色效应（hyperchronic effect）：核酸变性时，紫外吸收值A260随之升高的现象。 变性的因素 除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主要的是DNA分子中GC的含量，GC含量高的DNA不易变性，而AT含量高的DNA容易变性。 另外环状DNA比线性DNA难于变性。 3.常用变性方法(1)热变性 热变性 当温度＜70℃，DNA几乎不变性； 当温度介于70～90℃时，DNA部分变性； 当温度＞90℃，DNA完全变性； 当温度＞100℃，DNA双链分离； 通常核酸的变性温度可选在90～100℃之间。 (2)酸碱变性 当核酸溶液的pH低于3或高于10时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子； 在分子杂交中最常用的核酸变性方法是碱变性（因为核酸的载体物如凝胶或膜对热不稳定） (3)化学试剂变性 当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲酰胺、甲醛等时，双链间的氢键可以断裂形成单链核酸分子 二、复性（renaturation） 三、杂交（hybridization） 2．影响核酸分子杂交的因素： 核酸分子的浓度和长度 温度 离子强度 变性剂（甲酰胺） 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应 杂交温度： 温度一般选择低于 Tm值20-25℃ Tm=81.5℃ + 161.6logM + 0.41（G + C）% - 500/n - 0.61（甲酰胺%） M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性 四、预杂交（prehybridization） 1．概念：为了减少探针与膜等的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭，该过程称为预杂交。 第二节 核酸探针 probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。 双链探针：包括基因组DNA探针和cDNA探针 基因组DNA探针：由基因组文库筛选…标记 cDNA探针：由cDNA文库筛选…标记或者经RT- PCR法生成，mRNA → cDNA链→PCR扩增 核酸探针标记方法 放射性同位素的选择： 32P 优点：放射比活度高 缺点：半衰期短（14.3D）、散射严重 35S 优点：分辨率较高，半衰期长（87.4D）放射比活度高 缺点：放射比活度只有32P的1/6 3H 优点：半衰期长（12.3Y）、成像分辨率高，易于定位 缺点：活性低 单链DNA探针：利用M13噬菌体载体合成 单链RNA探针： 以dsDNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录合成，用无RNase的DNA酶Ⅰ处理，除去模板DNA 在5’或3’端通过酶促反应加上标记物 DNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法 T4 DNA聚合酶标记法 T4多核苷酸激酶标记法 末端脱氧核苷酸转移酶标记法：ddNTP为底物 DNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法 T4DNA聚合酶标记法 T4多核苷酸激酶标记法 非放射性标记核酸探针 生物素化核苷酸 标记方法： （2）光敏生物素标记法：强光10-20分钟 光敏生物素的结构 2．地高辛 ( digoxigenin ) 标记法 dig-dUTP的结构 第三节 核酸分子杂交技术 膜上印迹杂交 核酸原位杂交 一、膜上印迹杂交 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。 1．固相支持物的选择 （1）虹吸印迹法 （2）真空转移法 reverse dot hybridization 直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同