等电点沉淀分离.ppt

沉淀分离技术 组员：黎登峰 胡文广 叶智峰 黄木生 黄大继 等电点： 两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变，当两性离子正负电荷数值相等时，溶液的pH值即其等电点。 蛋白质可以用酸碱滴定法确定其等电点。（网上有介绍其他方法……） 两性与等电点 ??? 氨基酸具有氨基和羧基的典型反应，例如氨基可以羟基化、酰基化，可与亚硝酸作用；羧基以成酯或酰氯或酰胺等。此外，由于分子中同时具有氨基与羧基，还有氨基酸所特有的性质。 ??? 在水溶液中，氨基酸二偶极离子即可以与一个结合成为正离子，又可以失去一个成为负离子。这三种离子在水溶液中通过得到或失去互相转换同时存在，在PH值达到等电点时溶液处于平衡。 ???? 等电点不是中性点，不同氨基酸由于结构不同，等电点也不同。酸性氨基酸水溶液的PH值必然小于7，所以必须加入较多的碱才能使正负离子量相等。反之，碱性氨基酸水溶液中负离子较多，则必须加入酸，才能使正离子量增加。所以碱性氨基酸的等电点必然大于7。 ??? 各种氨基酸在其等电点时，溶解度最小，因而用调节等电点的方法，可以分离氨基酸的混合物 蛋白质在溶液中有两性电离现象。假设某一溶液中含有一种蛋白质。当pI=pH时该蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为0，此时的该溶液的是pH值是该蛋白质的pI值。某一蛋白质的pI大小是特定的,与该蛋白质结构有关，而与环境pH无关。 　　在某一pH溶液中当pHpI时该蛋白质带负电荷。反之pHpI时该蛋白质带正电荷。pH=pI时该蛋白质不带电荷 人体内pH=7.4；而体内大部分蛋白质的 pI6； 所以人体内大部分蛋白质带负电荷。 等电点沉淀的应用 等电点沉淀主要应用于蛋白质等两性电解质的分离提纯，还可应用于大豆异黄酮的分离：用等电点沉淀法脱去蛋白质，可提高异黄酮制品的纯度，异黄酮截留率为7.2%，蛋白质截留率为91.1%。 　　 大豆蛋白质在pH4.5左右达到等电点，此时其溶解度最低形成沉淀，利用这个性质来提取大豆分离蛋白，使大豆分离蛋白从提取液中聚沉下来，与其他可溶性物质分离。大豆分离蛋白不是在所有酸性条件下都沉淀，只有在等电点附近才沉淀，当pH调太低时溶解度反而升高，到pH2.5时，已沉淀的蛋白质就会几乎全部重新溶解，因此必须严格掌握酸沉所需的pH，才能有满意的效果。在分离中，大量的含磷化合物的存在是影响蛋白质提取的较大因素，最好除去植酸，可用透析法，也可根据蛋白质和植酸的溶解度的差异性将其除去。 　　大豆分离蛋白的一般工艺是用50℃温水萃取并离心，把豆渣用50℃温水和NaOH调整pH9进行二次萃取，并离心分离把分离出的豆浆进行酸沉，同时搅拌（60r/min），加入2%消泡剂和温水，加入适量亚硫酸钠调pH7左右，进行高速搅拌（120r/min）并加入3.5%HCL调至pH4.5，此时蛋白质在等电点开始沉淀，并经过一系列的工艺凝乳分离、均质、中和、杀菌干燥得成品。 等电点沉淀的缺点： 沉淀分离技术 （课本151页） 沉淀法： 利用某种沉淀剂或改变条件，使所需提取的物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 具有浓缩和分离的双重作用。 在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞组分的回收和分离中应用的很多。 沉淀法的分类 （1）盐析沉淀法（介绍） （3）等电点沉淀法（介绍） （2）有机溶剂沉淀 （4）其他沉淀法 …. 蛋白质的特性： ⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 ⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层） 因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。 一、蛋白质的盐析沉淀法 定义：在高浓度中性盐的作用下，蛋白质等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。 机理： （1）破坏水化膜； （2）中和电荷。 当向蛋白质溶液中加入中性盐时： 低盐--盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大) 高盐--盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小) 盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间排斥作用减弱 中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化作用从而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域 影响盐析效果的因素 蛋白质浓度 如：产生共沉效应（参照对比Ks值） 离子强度与离子类型 PH值（多选择在等电点处） 温度 二、等电点沉淀法 原理：两性物质在溶液pH处于等电点时，分子表面所带净电荷为零，分子间静电排斥作