基因工程第四章目的基因的分离和合成.ppt

苏州科技学院生物系 叶亚新 第四章 目的基因的分离与合成 通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因” 将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为“目的基因”。 获得目的基因进行分子克隆，一方面为了获得表达产物，另一方面就是要获得大量拷贝，以便进行基因结构和功能的研究 第四章 目的基因的分离与合成 获得目的基因的方法： 限制酶直接分离 从基因组文库中筛选 逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选 人工合成 PCR扩增 基因改造 第四章 目的基因的分离与合成 第一节 限制酶直接分离 一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基因的制备 对已定序列的DNA分子 只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割，分离纯化所需的DNA片断，与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。 对已知定位的目的基因 只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一次即可获得目的基因。 第一节 限制酶直接分离 二、 用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核生物基因的制备 采用鸟枪法（shot gun）： 从细菌细胞中分离细菌染色体 用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段 用相同的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体细胞 转化子的选择 第二节 建立基因组文库 三、建立基因组文库的主要步骤 1、利用λ噬菌体 获得目的基因的DNA片断 基因组DNA片段化的方法 物理学方法：机械力和超声波 生物化学方法：限制酶（四个核甘酸序列识别位点的酶） 与噬菌体克隆载体重组，体外包装成噬菌体颗粒 转染宿主菌 筛选培养 第二节 建立基因组文库 三、建立基因组文库的主要步骤 2、利用Cosmid 基本与用λ噬菌体载体构建基因组文库相似。 有如下不同： 制备基因组DNA须特别小心必须保证DNA分子尽可能大 载体的处理比较简单 连接重组时，cosmid的量要比插入片段的量高10倍以上 包装转染后在平板上出现的转化菌落，不是嗜菌斑 第二节 建立基因组文库 三、建立基因组文库的主要步骤 3、利用YAC 选用限制酶EcoRI和BamHI对pYAC4载体作双酶消化 选用适当的方法制备生物体完整的染色体DNA，并将其片段化 收集纯化大片段DNA，并与YAC臂连接 转化去壁酵母细胞，利用存在于两臂上的选择标记，筛选含有YAC两臂的酵母细胞 第三节 cDNA基因文库的构建 一、cDNA基因文库的概念 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA基因文库 cDNA序列只与基因的编码序列有关，不能反映基因的内含子，也不能反映基因的转录启动子、终止子等非转录序列 cDNA基因文库可分为表达型和非表达型 表达型cDNA文库的构建：λgt11 非表达型cDNA文库的构建：λgt10 第三节 cDNA基因文库的构建 二、cDNA基因文库的构建 细胞总RNA的制备及mRNA的分离 cDNA第一条链的合成 双链cDNA的合成 cDNA与载体的连接，重组到相应的载体上，导入受体细胞增值 二、cDNA基因文库的构建 细胞总RNA的制备及mRNA的分离 总RNA：mRNA、tRNA、rRNA mRNA的分离纯化 利用真核生物mRNA其3‘末端的poly（A）尾巴与oligo（dT）配对特性，制备oligo（dT）型纤维素亲和层析柱 二、cDNA基因文库的构建 以mRNA分子为模板，合成cDNA分子第一链 Oligo（dT）引导的cDNA合成法 随机引物引导的cDNA合成法 二、cDNA基因文库的构建 双链cDNA分子的合成 自我引导合成法 碱处理mRNA-cDNA杂交分子，降解mRNA 单链cDNA在3‘端易发生自身环化形成发夹结构为cDNA第二链的合成提供引物 在klenow酶的作用下合成cDNA第二链 用S1酶切割除去单链发夹结构 二、cDNA基因文库的构建 双链cDNA分子的合成 置换合成法 RNA酶H和E.coli DNA聚合酶I混合处理mRNA-cDNA杂交分子， RNA酶H在杂合双链mRNA链上产生缺口并形成部分cDNA单链区 DNA聚合酶I以残存的mRNA作为引物合成cDNA第二链 T4-DNA连接酶修复缺口 二、cDNA基因文库的构建 双链cDNA分子的合成 引物合成法 在第一链合成完毕后，变性残留的mRNA，用末端转移酶在cDNA游离的3‘羟基端添加同聚物（dC）末端 将其与人工合成的oligo-dG退火，形成引物结构 在klenow酶的作用下，合成第二条cDNA链。 PCR法 二、cDNA基因文库的构建 二、cDNA基因文库的构建 双链cDNA克隆的