免疫固定电泳.doc

PAGE PAGE 5 标题：免疫固定电泳 版本号：A 文件编号：PLA301-LJK-ZY-MY-24 发布日期：2003年3月1日 生效日期：2003年3月15日 发布部门：临检科质量管理小组 编制人：马骏龙、白洁、杨丽 审核人：马骏龙 批准人(签章)：秦小玲 页码：第1页，共6页 免疫固定电泳 1 检验目的 免疫固定电泳是通过分析单克隆Ig的轻链和重链类型，帮助诊断多发性骨髓瘤、重链病、轻链病及半分子免疫球蛋白病的分型诊断，观察疾病的变化及治疗效果具有重要参考价值。 2 检测原理 免疫固定电泳(immunofixation eletrophoresis，IFE)将血清或其他标本在琼脂(醋酸纤维素)平板上作区带电泳，各种单一蛋白或复合蛋白成分经电泳后按其电荷量、分子大小等所致电迁移率不同而分开。然后在其上加入已知相应单价抗血清(分别含有抗κ、λ轻链及各类重链抗血清)，当抗体与其区带中的单克隆Ig结合后，便形成抗原抗体复合物而沉淀(固定)下来。通过漂洗和染色，呈现浓而狭窄的着色区带，即可判断单克隆Ig的轻链和重链类型。 3 标本 3.1 静脉抽取病人空腹血标本2ml，置于含分离胶或含促凝剂的真空试管内。 3.2 采血后应立即送到临床检验科免疫检验室。 3.3 样品收到后不能及时测定的血清，应于2℃～8℃冰箱保存。 4 设备和试剂 4.1 HYDRASYS电泳分析仪(主机号：1423或1876)和HYRYS-PHORESIS光密度扫描系统。 4.2 琼脂糖凝胶：法国Sebia公司的琼脂糖凝胶(产品PN4150或4152)为应用型，凝胶内含8g/L琼脂糖和Tris巴比妥缓冲液(pH9.1±0.1)。 4.3 Tris-巴比妥缓冲液：每1份浓缩缓冲液瓶内加1升蒸馏水或去离子水，稀释后Tris-巴比妥溶液为应pH9.1±0.3。浓缩液可置于室温或冰箱内保存，质量可稳定几年或至少在试剂盒和缓冲液瓶上标签注明的有效日期内。 4.4 氨基黑染色液：每1份浓缩染液用蒸馏水或去离子水稀释到300ml，稀释后为工作液(4g/L氨基黑、10%乙酸)。浓缩和稀释液可置于室温或冰箱内保存，浓缩液质量可稳定在试剂盒瓶上标签注明的有效日期内；已稀释的缓冲液盖紧瓶盖在室温内可稳定1年。 4.5 结晶紫染色液：1份浓缩结晶紫溶液内加蒸馏水或去离子水至300ml，稀释后为工作染色液(2g/l结晶紫和10％乙酸)。将浓缩或稀释之染色液瓶盖拧紧，避免蒸发并置于室温或冰箱内保存。浓缩染液始终保持稳定，至少可稳定在试剂盒瓶上标签注明的有效日期内，已稀释之染液可稳定6个月。 4.6 稀释液、固定剂和抗血清：稀释液为应用型(pH为7.5±0.3的碱性缓冲液、溴酚蓝和防腐剂)；固定液为应用型(内含酸性溶液和防腐剂)，为便于区分，固定液具有特殊的颜色以避免混淆。抗血清均为应用型，所有抗血清内含哺乳动物相应抗人免疫球蛋白抗体，为便于分辨，抗血清的颜色与标签所示颜色一致。在抗血清瓶的标签或试剂盒上注明的有效期内均可使用。 4.7 脱色液：浓缩脱色液用蒸馏水或去离子水100倍稀释后为脱色应用液(稀释后脱色液内含柠檬酸5g/L)。脱色液用于凝胶染色后的脱色，以去除剩余的染料。稀释脱色液须拧紧瓶盖，置于室温下可稳定1个月。 5 操作步骤 5.1 样品准备 选择合适的琼脂糖凝胶，每片2IF可检测2个标本，每片4IF可测定4个标本。为了避免由抗原过剩引起的带现象，样本须先如表1稀释后再进行点样。当总免疫球蛋白水平＞20g/L时，稀释剂量加倍(ELP泳道除外)；当总免疫球蛋白的水平＜5g/L时，稀释剂量减半(ELP泳道除外)。 表1 免疫固定电泳检测血清样品稀释 泳道 氨基黑染色 结晶紫染色 血清 稀释剂 血清 稀释剂 蛋白电泳图谱(ELP) 30 μl 60 μl 30 μl 60 μl IgG免疫固定泳道 20 μl 100 μl 20 μl 100 μl 其它免疫固定泳道 30 μl 60 μl 30 μl 60 μl 某些单克隆免疫球蛋白可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段，在这种情况下，应先将血标本进行处理，用5μlβ-巯基乙醇加于100μl未稀释的血清内，混匀并放置1～2分钟后按规定程序继续进行。 5.2 操作方法 法国Sebia公司的Hydrasys电泳系统是一种半自动的多元仪器，自动化步骤包括：电泳、用固定剂和抗血清孵育、烘干、染色、脱色和最后烘干。手工步骤包括：加样和处理凝胶、加固定剂和抗血清以及启动仪器。 免疫固定是由五种混合多价抗血清进行反应，其步骤为：①应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。使电泳后已分离的蛋白质被固定和产生免疫沉淀。②使用吸水纸和清洗液将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。