浙江大学细胞培养基本技术课件.ppt

浙江大学细胞培养-基本技术;1、细胞培养技术;1.1 细胞的原代培养;意义;掌握无菌操作技术 了解小鼠解剖操作技术 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 了解培养细胞的消化分散 了解倒置显微镜的使用;实验材料;原代细胞培养方法;贴块法;分次消化;外植块培养步骤图解;操作步骤1 --- 取材;操作步骤2 ---切割;;胰酶消化法操作步骤 --- 消化、接种培养;胰酶消化法操作步骤 --- 消化、接种培养;组织块直接培养法操作步骤 ;原代细胞培养结果;1.2 传代细胞培养;细胞传代方法;消化法传代培养步骤;选取生长良好的???胞，在超净工作台的酒精灯 旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2-3 ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？） 加入适量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液 用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。 以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀， 37 ℃CO2培养箱培养。 观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。;传代细胞培养结果;取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管 把培养瓶中的细胞吹打均匀。 转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000 rpm/min）5min。(区别贴壁传代) 在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。 以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。 观察：细胞培养24h后，即可进行观察。;要预先与临床外科医生和护士商量，并做好一切必要的准备工作。争取拿到的标本新鲜、无菌、少坏死等。 联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备1-2个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清取手术标本的部位及注意事项。;标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料的瓶子盖好后，放入4℃冰箱，尽快打电话通知工作人员。 取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。;整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使用冰冷的液体。 在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。 整个取材过程耗时越短越好。在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的(4 ℃)含平衡盐溶液(或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好不超过24-48 h(视不同组织类型而定)。;1.4 培养细胞生长测定;细胞计数;细胞计数;细胞计数;由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约2 min）。;①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。 ②2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。;细胞生长曲线的绘制 ;1)培养细胞 首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0 h。 2)计数细胞密度 从接种时间算起，每隔24 h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2-3次。如此操作至第七天结束。;四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，用酶标仪测定OD570nm值。 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。;操作步骤;1.5 细胞冻存和复苏;细胞冻存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在冷冻保护剂的溶液中，以一定的降温速率降至零下某一温度(-70 ℃)，并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：以一定的复温速率将冻存的培养