荧光定量PCR技术原理 方法 数据分析详述.pptx

广州维伯鑫生物科技限公司 GUANGZHOU VIPOTION BIOTECHNOLOGY CO., LTD; Q-PCR技术培训 匡杰斌 广州维伯鑫生物科技有限公司 技术服务部 2013.12.13 ;RNA提取;RNA提取方法 RNA纯度与质量考察 RNA提取常见问题及解决方案;样品;异硫氰酸胍/苯酚法 在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 ;组织/细胞样品RNA提取; 纯度：紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收，以A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。 蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以280nm常用 来表示蛋白质吸光度；而260nm为核酸的吸光度。 理论上，纯的RNA情况下：OD260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：OD260/OD280的值为1.8。 实际所用RNA应处于1.8-2.0之间，最好是1.9-2.0之间。 质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。;RNA提取常见问题及解决方案;RNA的降解;RNA的保护;蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 ;OD260 /OD280 比值偏低; 非变性电泳： 上样量超过 3μg，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。;荧光定量PCR;RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 ; 逆转录PCR，将mRNA逆转录后在进行PCR扩增，产物通过电泳检测基因的表达情况，又称半定量PCR。 主要用于定性检测。;RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 ;实时荧光定量PCR技术的应用;绝对定量VS相对定量;Real-time qPCR原理;Real-Time qPCR主要概念;Real-Time qPCR曲线的意义;实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。 非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。 探针类(TaqMan探针和 分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。 后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但前者则简便易行。 ;SYBR Green I 工作原理;TaqMan探针工作原理;荧光阈值(Threshold);Ct 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表 Ct 值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。;RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 ;Real-time qPCR成功因素;反应体系： 模板浓度不要太高，反转录最多1μg总RNA， PCR一般1μL反转录产物； 引物浓度一般100nM-1mM； 根据kit要摸索最佳反应条件 小心操作： 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样，即使是混 合液！每个样品至少要做3个平行孔。每组实验最好有3个重复，做统计 分析。 ;RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 ;Real-time qPCR数据分析;绝对定量;绝对定量数据分析;相对定量;相对定量数据分析;实