蛋白质的表达纯化.ppt

实验八 蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 (1)了解重组蛋白表达的方法和意义。 (2)了解亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。 本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 材料与试剂 试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM 2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer(洗脱): 100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 [6] IPTG 实验步骤 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中 （含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。 二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化 1.重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB, 用吸管抽吸重悬, 4 ℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。 2. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟 ) 。 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液。 4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS分析。 5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.5－1 mL，共收集6－10管，分别取10ul样品用于SDS分析。 1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。 30%Acr-Bis Tris-HCl pH 8.8 H2O 10%AP TEMED 5ml 3ml 4ml 120ul 20ul 灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限） 3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配方如下： 30%Arc-Bis Tris-HCl pH 6.7 H2O 10%AP TEMED 400ul 750ul 1800ul 50ul 10ul 4. 灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。 5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10?L。 6．电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止电泳。 7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉, 剥下凝胶，准备染色。 8． 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（