毕赤酵母表达知识.doc

实用标准文档 文案大全 很好，需要好好研究一下 原文地址： \o 毕赤酵母表达知识01转载于丁香 毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者： \o 思时尔非 思时尔非 a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。 D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛 高拷贝的，是否PCR验证一下即可？ 网友的回答： ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。invitrogen手册上可以灭菌的。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。 想请教下关于菌种保存的方法。我现在是采用斜面保存的方法，但感觉每次接菌都要打开斜面，而且每次的接菌量难免会有不少的误差，所以很想问一下大家都是怎么保存菌种的，特别是甘油菌的保存方法。我一般吸取300ul的菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀．防于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱一般OD是2-6，过夜菌在筛选高表达菌种中，我一般有一下步骤，很很多人做的不太一样，和说明书也有点差异，如下：每次转化前，均用多种酶切，BlgII/salI/sacI同时切，然后转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，这里我要重点说明的是，我直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。我已用这儿方法做了好几个基因出来。 关于酵母表达时BMMY的PH值我也觉得PH7.0-7.5要比PH6.0好，我表达的两个蛋白都是这样，表达量要高一些。但也不能一概而论，不同目标蛋白表达最适pH不一样，不过表达的pH值最好要远离目标蛋白的pI。像目前国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右，也有不同的报道，可能和工艺页有关系。而我自己正在做的一个蛋白pH4较好，3、5表达时上清电泳目标带大量减少，杂带大量增多。 求助一下很棘手的问题，大家在酵母表达过程中控制目标蛋白降解方面有什么高招，小弟最近为这个有点儿焦头烂额。我试过用酸消解酪蛋白，可是作用并不是很明显。 不知道兄台是胞内表达还是胞外表达，如果是分泌表达，目标蛋白确实容易被降解。你可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。 Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the