实验二血清蛋白电泳实验范玉平讲义.ppt

实验二血清蛋白电泳实验范玉平 血清和血浆 血清:是指离体的血液经过自然凝固而析出的液体部分.血浆:是指离体并经过抗凝的血液经过离心沉淀后的上清部分.血清中无纤维蛋白原 简 介 人类血液中有125种以上蛋白质成分。 白蛋白、脂蛋白、抗体、补体、凝血酶原和凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、 α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、转铁蛋白和其他微量蛋白等成分。 历 史 1809年，Pehce(俄国物理学家)首先发现电泳现象 1937年，Tiselius(瑞典)制成界面电泳仪，应用于蛋白质研究 1948年，Wieland和Fischer建立了滤纸电泳法，奠定了区带电泳技术的基础 1959年，Raymond和Weintraub创建聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳和电泳技术 电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 应用 电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外,最主要用于蛋白质,核酸等生物分子的研究.由于电泳法设备简单,操作方便,具有高分辨率及选择性特点,已成为医学检验中常用的技术. COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 电泳用于分离物质的原理 电泳分类 按分离的原理不同：区带电泳、自由界面电泳、等速电泳、等电聚焦电泳 按支持介质的不同：纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 按支持介质形状不同：薄层电泳、板电泳和柱电泳 按用途不同：分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳和连续制备电泳。 影响电泳的因素 在电泳中,电场,带电粒子和促使带电粒子移动的介质是产生电泳的三大要素.因而,影响电泳的主要因素有： 电场强度的影响 溶液的pH值 溶液的离子强度 电渗 温度、分子大小、吸附作用等 电 渗 液体对固体支持物的相对移动，由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间产生的一种相关电荷所引起。如果电渗与电泳方向相同，V变大；反之变小。 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 原 理 在 pH8.6碱性环境，血清蛋白均带负电荷，在电场中向正极移动 各种蛋白质pI不同，带电荷量有差异 蛋白质的分子大小与分子形状不相同 带电荷多、分子量小者，泳动较快；反之则较慢 蛋白质的等电点、分子量及迁移率 蛋白质名称 等电点 相对分子量 电泳迁移率 白蛋白 4.84 6.9万 5.9*10-5 α1-球蛋白 5.06 20万 5.1*10-5 α2-球蛋白 5.06 30万 4.1*10-5 β-球蛋白 5.12 9万～15万 2.8*10-5 γ-球蛋白 6.86～7.30 15.6万～30万 1.0*10-5 电泳结果示意图 γ β α2 α1 清蛋白 染色时染料与蛋白质特异结合而不与醋纤膜结合，染色深浅与蛋白质的量成正比 染色一段时间后脱色，将各蛋白区带剪下，经脱色、比色即可计算出各蛋白质组分的相对百分数。 如同时测定出总蛋白浓度，还可计算出各蛋白组分的绝对浓度 正常血清电泳扫描图谱 试 剂 缓冲液：巴比妥缓冲液（pH8.6 ） 染色液：丽春红S染色液 漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液 洗脱液：0.1mol/LNaOH溶液 操 作 准备 电泳槽准备 CAM的准备 点样 吸3-5μl血清均匀点于CAM无光泽面 电泳 无光泽面朝下，点样侧置于负极端，通电 染色 将薄膜条浸入丽春红S染色液，染5-10min 漂洗 醋纤膜规格及点样示意图 定 量 取试管6支，在白蛋白管内加入0.1mol/L NaOH液6ml，其余各管加入3ml，将各蛋白区带剪下分别置于各试管中，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，37℃10-20min 向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加0.3ml,以中和部分NaOH 用520nm比色，以空白管调零，读各管吸光度 计 算 设各部吸光度分别为AA、Aa1、Aa2、Aβ、Aγ。吸光度总和（AT）为： AT= AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ 白蛋白（%）＝（AA *2 AT）*100% a1-球蛋白（%） = （Aa1 A