第七章 特殊制片方法.ppt

栉孔扇贝肠上皮中碱性磷酸酶 第七章 第七节 细胞和组织化学法 四、酸性磷酸酶显示法 （Gomori） β－甘油磷酸钠 （Mg2+） 酶 酸性条件 pH4.7 磷酸根 磷酸铅 +（NH4）2S PbS↓ + pb2+ 第七章 第七节 细胞和组织化学法 栉孔扇贝肠 栉孔扇贝消化盲囊 第七章 第七节 细胞和组织化学法 四、酸性磷酸酶显示法 （Gomori） 第八节 免疫酶细胞化学技术 免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC) 常用方法之一。 （免疫组织化学技术immunohistochemistry） 是在抗原抗体特异反应存在的前提下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质(抗原/抗体)在组织细胞内的存在部位。 第七章 2种基本染色法: * 直接法: 第一抗体被标记。 * 间接法: 第一抗体也被看作抗原，而第二抗体被标记。 特点：信号被放大，因此更加敏感 一、免疫组织化学技术的原理 第八节 免疫酶细胞化学技术 第七章 免疫荧光技术 免疫酶技术 免疫金技术 据标记物类别分为： 蛋白A胶体金法 第八节 免疫酶细胞化学技术 第七章 二、免疫组织化学技术的基本要求： 1. 不损伤组织细胞的结构 2. 有很强的特异性 3. 有很高的灵敏性 4. 不造成受检物质的移位和丢失 5. 不影响抗体和抗原的免疫活性 6. 在组织细胞中形成的免疫结合物借标记物而清晰可见 第八节 免疫酶细胞化学技术 第七章 三、ICC标本的制备：固定、切片、染色 关键：组织抗原的免疫活性保存好，且不弥散丢失 （迅速充分）固定 AMEX法 微波固定 （acetone meth enzoate xylene） 丙酮 苯甲酸脂 二甲苯 石蜡包埋标本 各种切片材料 抗原修复 第八节 免疫酶细胞化学技术 第七章 四、酶的标记与染色方法 1. 酶标抗体法 通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，在光镜下或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶 第七章 第八节 免疫酶细胞化学技术 2. 非标记抗体酶法 酶不是作为标记物来标记抗体，而是作为抗原免疫动物，制备抗酶抗体。 酶桥法 桥抗体 抗原 第一抗体 第二抗体 抗酶抗体 酶 桥抗体 抗原 第一抗体 第二抗体 PAP复合物 PAP法 （过氧化物酶抗过氧化物酶法） 第七章 第八节 免疫酶细胞化学技术 第九节 间接免疫荧光抗体技术（补充） （1）冰冻切片，丙酮固定，PBS冲洗； （2）LCDV单克隆抗体涂于切片表面，湿盒内孵育45-60min，37℃，用PBS代替一抗作阴性对照。瘤组织切片作为阳性对照． （3）0.01mol/LPBS（pH7.4，含0.85%NaCl）洗5min×3次， （4）加第二抗体IgG-FITC，按同样方法处理60min，PBS冲洗3次。 （5）甘油:磷酸缓冲液9：1（V/V）混合液封片，荧光显微镜观察。 例：牙鲆病理组织中淋巴囊肿病毒（LCDV）的检测 洗 涤 封 片 第七章 复习题： 1.所讲制片方法的原理与制片时应注意问题。 2.什么是细胞和组织化学法？其原理？ 3.Schiff（席夫）试剂中的碱性品红为什么无色？ * * 线粒体在细胞的分布也因细胞的类型不同而不同。其分布有一定的规律，通常分布于生理功能最旺盛的区域和需要能量较多的部位。如蛋白质合成旺盛的细胞，肠上皮细胞（细胞的两极）。 哺乳动物成熟的红细胞中无线粒体；正常细胞中含有1000-2000个线粒体；精子的线粒体较少约有25个左右。 * 存在于所有细胞中，最早是在神经细胞中发现的，呈典型的网状或线状即小粒状。常成群地分布于核旁。 * 肝糖是一种多糖类，也称糖原，是能量的储备物，各种细胞都可以有少量的糖原，在细胞中多呈颗粒状，以肝细胞和横纹肌最多，糖原在生活细胞是胶状的，溶于水，死后很快分解。 要用新鲜材料，不能用水溶性固定剂。一般用无水酒精固定，但这会使细胞内的分子移位和集结、但对结构无影响。 固定肝糖比较好的固定剂是Gendre氏液。 * Feulgen反应是Feulgen1924年提出的。 DNA与RNA都是由五碳糖，磷酸根，含氮碱基组成。DNA与RNA差别在五碳糖上。五碳糖与磷酸根形成骨架结构。五碳糖与含氮碱基之间通过N-糖苷键连接。 嘌呤碱： Adenine （A) 腺嘌呤；Guanine （G）鸟嘌呤 * 可用显微分光光度计作DNA定量研究。 * 2012.11.21 * 碱性磷酸酶是生物体内的一种重要的代谢调控酶，直接参与磷酸基团的转移，参与钙磷代谢。碱