遗传毒物与细胞死亡.ppt

* * 2、活性氧离子(ROS)和细胞氧化还原(redox) 许多刺激引起凋亡过程中有超氧化物和脂质过氧化物的增加，但它发生在半胱天冬酶激活之后。细胞色素。的释出也可导致线粒体ROS生成增加和ATP生成减少。 3、线粒体外膜破损 线粒体渗透性转换小孔开放将导致线粒体基质和线粒体内外膜间隙中，发生离子平衡而使内膜两侧H+梯度消失，还将导致因基质高渗而引起的线粒体容积失调，最终引起外膜破损。 * 第五节 细胞凋亡的生物学特征及其检测 * 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 * * 2、 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。　　常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2-5mg/ml。　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5-1mg/ml。 * * 　3、 透射电子显微镜观察　　结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 * * * * 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 * * * * * * 三、线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 　 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 * * 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180?200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。 四、DNA片断化检测 * * SPC-A1（人肺癌细胞），10ug/ml顺铂（终浓度）处理，每隔8h，进行分析图片说明：凝胶两端为lamda marker，从左至右分别为空白（未用顺铂处理），处理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h， * * MCF-7-C1 Con ATO 5?M sub-G1 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析 * * 五、 TUNEL法 　　 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3‘