52011第五第二章基因工程载体和工具酶201198.ppt

大肠杆菌乳糖操纵子的调控 操纵子与操纵子模型 操纵子学说/操纵子模型： F.Jacob J.Mond（1960）E.coli lac operon( 1965诺贝尔医学生理学奖) 操纵子：核酸分子上调控基因转录活性的基本单元，由结构基因、操作子（O）和启动子（P）组成。 转录、翻译、合成蛋白 结合调节蛋白 结合RNA聚合酶 叫5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷 * （6） 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。 注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。 1）普通载体元件 ① 表达载体的结构 promoter structural genes operator 启动基因 操纵基因 结构基因 操纵子(operon)模型 调控（节）蛋白 操纵子 RNA R P O structural genes DNA Protein ＋ 正调控（positive regulation) － 负调控 (negative regulation) 调控蛋白的作用机制 注：R：Regulator P：Promoter O：Operator 正调控系统中的正调控蛋白又被称为无辅基诱导蛋白（apoinducer) 负调控系统中的负调控蛋白又被称为阻遏蛋白（repressor) (四)经典的大肠杆菌质粒载体 1. pSC101 第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。 （1）类型 天然质粒，属低拷贝型。 （2）长度 9.09 kb。 （3）选择标记 四环素抗性Tetr 6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。 （其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于选择标记Tetr的内部） （4）克隆位点 2. ColE1 （1）类型 天然质粒，属高拷贝型。 （2）长度 6.3 kb。 （3）选择标记 大肠杆菌素（colicin）E1 对E1免疫的基因（immE1） 特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！ ① colicin E1基因的结构 cea imm kil 结构基因 免疫基因 溶菌基因 ② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因 EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。 EcoR I （4）克隆位点 Colicin E1 外源DNA 无Colicin 3. pBR322： F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。 “P”表示是一种质粒(plasmid)； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个 字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示实验编号。 pSP2124质粒的Ampr基因 （1）元件来源 ① 复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点 ② Ampr基因 ③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。 （2）长度 4361bp （3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。 （4）克隆位点 其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。 24个克隆位点。 （5）pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞? 在Amp或Tet中都死亡。 获得载体的寄主细胞? 在Amp或Tet其中之一中死亡。 外源基因?BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡 外源基因?Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡 每个细胞可达1000~3000copy ④ 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。 ③ 高拷贝数 ② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 保留了转移蛋白（mob）的作用位点。 （6）p