第七章DNA测序技术.ppt

荧光自动测序技术基于原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。这种测序技术属于代测序。 * Illumina测序仪通常也被称作Solexa测序仪 * * * SOLiD用的是与454技术类似的乳液PCR对要测序的片段进行扩增，接下来的连接测序反应这一步可就是SOLiD的独门秘笈了。它的独特之处在于没有采用惯常的聚合酶，而用了连接酶 * 这一步可就是SOLiD的独门秘笈了。它的独特之处在于没有采用惯常的聚合酶，而用了连接酶 * 以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。 * SMRT是以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术之一。 * Solexa优势与误差来源 技术优势：测序性价比最高，运行成本低； 可扩展的高通量； 需要样品量少； 简单、快速、自动化 误差来源：每次添加核苷酸之前对荧光信号的 切割，如果切割不完全，产生误差。 Heliscope单分子测序仪 原理：将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子并且在每个片段末端加上poly-A尾巴。通过poly-A尾和固定在芯片上的poly-T杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片。最后借助聚合酶将荧光标记的单核苷酸掺入到引物上。采集荧光信号，切除荧光标记基团，进行下一轮测序反应，如此反复，最终获得完整的序列信息 Heli Scope的优势 单分子测序减少了试剂的使用，测序成本价格大大降低。 不需要扩增建立DNA库，从而减少误差。 SMRT技术 原理：SMRT芯片是一种带有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度为100 nm的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应 。当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。 SMRT测序流程 SMRT测序的特点及优势 特点：边测序变合成，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。 优势：1、速度很快，利用这种技术测序速度可以达到每秒10个dNTP 2、信号强度大。由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间（微秒级） 相比会很长，所以信号强度会很大。 纳米孔单分子技术 原理：以α-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。 纳米孔单分子测序的优势 1、准确度高，纳米孔单分子技术准确率能达到99.8%，且一旦发现替换错误也能较容易地更改。（因为4种碱基中的2种与另外2种的电信号差异很明显，因此只需在与检测到的信号相符的2种碱基中做出判断，就可修正错误。）2、另外由于每次只测定一个核苷酸因此该方法可以很容易地解决同聚物长度的测量问题。 3、不需要荧光标记 面临问题：寻找合适的外切酶载体以及承载纳米孔平台的材料 sanger * * 四种双脱氧核苷三磷酸分别加入一个至不同的反应体系中。分4泳道电泳，统一读取。将四条一样DNA放到四个相同的试管，四（1，2，3，4）个试管原料的组成为：dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddATP；dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddGTP；dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddCTP；dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddTTP。这样在1，2，3，4试管中遇到A，G，C,T碱基就会有继续或停下两种可能，所以产生不同的片段。然后再电泳，根据各个片段的长短，读出序列。 * 第七章 第一代测序技术的缺点 测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。 测序反应费时费力——科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。 测序准确度不高——DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误 测序基于PCR反应，需要引物并且有些结够复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。 GS FLX测序技术 原理：一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧