4细胞培养-正常组织细胞的培养.ppt

几种细胞培养方法举例 表皮细胞 在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质，因此体外培养培养需要使用某些基质、培养液及包括滋养层在内的一些添加物。 几种细胞培养方法举例 无菌切取皮肤标本，用DBSS冲洗3～5遍。 将标本的上皮层面朝下放入干燥的培养皿中，加数滴PBS使之湿润，用弯剪尽可能除净皮下脂肪和结缔组织，将标本切成大约1cmX2cm的小块。 用无Ca2+、Mg2+的PBS 冲洗标本至少3次，将标本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶II中，4℃放置15-48h，或37℃ 1-3h。 表皮层和真皮层分离时,表皮层为棕色，真皮层为白色，观察到表皮与真皮分离时将其一如到另一10cm塑料平皿，真皮向下，用5ml血清完全培养液冲洗，用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入含20ml培养液的50ml离心管中，反复吹打，过100目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。 几种细胞培养方法举例 滋养层细胞制备 在已形成单层的3T3细胞培养瓶中加入丝裂霉素，使3T3细胞不在分裂增殖，即可作为表皮细胞的黏附滋养细胞。 黏壁剂包被 用0.01%的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，过夜，弃上清，40℃烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫外线照射2h消毒备用。 几种细胞培养方法举例 以1～5X105个细胞的密度接种在适量DMEM或FAD培养液中，37℃培养1-3天，细胞贴壁后，冲洗未贴壁细胞。 传代培养：0.05%-0.1%的EDTA孵育10-30min，细胞变圆后，在用0.1%的胰蛋白酶和0.05%EDTA消化，吸管吹打是细胞完全脱壁。 几种细胞培养方法举例 对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股骨腔的方法获得。 * 几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞 松开一端血管钳，将含有内皮细胞的消化液收集到离心管中，然后注入含10％胎牛血清的RPMI1640培基终止消化并冲洗血管，以便获取更多的内皮细胞。 * 几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞 将冲洗液一并注入离心管，以1000 rpm离心 l0分钟，弃上清液，加RPMI 1640培养液，接种于50ml一次性塑料培养瓶中，置37℃培养箱内，在5％C02 24小时后换液一次，除去红细胞和未贴壁的细胞继续培养，隔两天换液一次。 * 几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞 * 几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞 * 几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞 将手术取下的新鲜的滑膜组织置于无菌的平皿中，剔除脂肪组织，用含青、链霉素的D-Hanks洗涤两次，用眼科剪将滑膜组织充分剪碎，吸入螺口管中，1200rpm/min，离心10分钟。 * 几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞 离心后，弃上清，加入一倍体积的0.4％II型胶原酶，置于37℃ 5％CO2培养箱中消化60分钟（每15分钟吹打一次）。初次消化后，离心弃上清，再加入一倍体积的0.25％胰蛋白酶继续消化30分钟。最后加入含15％血清的RPMI1640培养液终止消化。 * 几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞 消化后的细胞悬液经200目的筛网过滤并离心洗涤两次，再用含10％小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃5％CO2培养箱中培养24小时，轻轻去除仍悬浮的细胞，继续培养，每3天换液一次,约10天左右可长满瓶底。 * 几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞 细胞长满培养瓶后即可进行传代培养，用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化后按几种细胞培养方法举例 * 几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞 * 几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞 * 几种细胞培养方法举例 乳鼠心肌细胞 分步消化法 实验材料 小鼠 小鼠的抓法： 从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。 小鼠的处死：颈椎脱位法 右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。 股骨骨髓细胞悬液的制备 冲洗骨髓腔 ： 用剪刀剪开股骨的一端，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端，用D-Hank’s液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中。 * 主要内容 培养细胞的取材 组织材料的分离 原代细胞培养 几种细胞培养方法举例 建立细胞系 * 建立细胞系 细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。 * 建立细胞系 细胞系 无限细胞系大多已发生异