第二章分子克隆工具酶.ppt

第二章 分子克隆工具酶Enzymes Used in Molecular Cloning 在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。 在体外对DNA进行分离纯化、连接重组或者修饰合成等，都会涉及一系列酶促反应。 用于基因工程的工具酶种类繁多，根据其功能可粗略分为限制酶、连接酶、聚合酶和修饰酶4类。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶 (如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶 ”。 工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己 DNA 的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。 第一节 限制性内切酶 restriction ednonuclease 1968年，Meselson and Yuan 从E. coli菌株Ｋ和Ｂ中发现了Ⅰ型限制酶； 1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindⅠ和Hind Ⅲ 迄今已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶， I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。 限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生物中没有限制酶。 一、限制酶的命名与分类 1、命名 1973年H.O. Smith和D. Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 ①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus); 第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)，正体。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示，正体写在第4个字母之后，字母间无间隔。 例：EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ 2、分类 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 Ⅱ型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只在单链上产生切口，Ⅱs型识别序列和切割位置特殊。 ?6 个碱基识别位点： EcoRⅠ G↓AATTC?　 HindⅢ 　 ?A↓AGCTT ?7 个碱基识别位点：BbvCⅠ ?CC↓TCAGC? 　　　 PpuMⅠ ?RG↓GWCCY ?8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC ?　　　 SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC 常用的限制酶及其识别序列和切割位点 六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（酶切反应条件） （5）反应时间：较纯的DNA（如试剂盒提取）在标准酶用量下反应1-4 h后可以达到完全，低的DNA纯度会降低酶切效率，增加酶的用量可缩短酶时间（但会增加星活力风险），延长反应时间可以减少酶的用量，进行部分酶切时要大大缩短反应时间并减少酶的用量，真核生物尤其是植物基因组总DNA完全消化（如Southern）时一般要消化24 h左右。 （6）终止酶切反应的方法：添加EDTA、加热法、纯化法。 七、酶切位点的引入 现代基因工程中通过引物化学合成等方式可以很方便进向目标位置引入设计的酶切位点。 通过不同酶切末端的连接重组也可产生新的酶切位点，对具体情况的分析在设计中有价值： 5’突出末端补平后重连； 同尾末端连接； 平末端连接。 （1）将产生的 5 突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点。 第二节 甲基化酶 Methylase 一、甲基化酶的种类 原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（methylase），又称甲基转移酶（methyltransferase），大肠杆菌中有3种。 1、Da