04动物细胞培养-HXY.ppt

4.5.2 细胞的复苏 （1）快速解冻：1-2min升温到常温，使细胞迅速通过最易受损的-5--0℃，避免重结晶 （2）解冻操作过程动作要轻 特别注意： 解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免冻伤 冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染 复苏细胞的方法: 从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中快速解冻。 将1－2ml 冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。 用800-1000rpm离心2－3 分钟（ 5min），弃上清液。 用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。 接种细胞到培养瓶中，起始密度不低于3×105/ml。24-48h 后换液。 1. 贴身运输 2. 冰瓶运输 3.液氮罐运输 * 4.5.3 细胞的运输 * 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 * 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 * 各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。 * 传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。 * 初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。 * 细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。 DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制 DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜 * ②胶原酶消化法：胶原酶是由细菌中提取出的酶，适用于消化纤维组织、上皮组织或胶原成分的组织。可用含钙、镁离子的BSS配制或溶于含血清的培养液中。使用浓度一般为0.1-0.3mg/mL，37℃温育。 优点：消化缓和、无需机械振荡 缺点：价格昂贵 可与胰蛋白酶混用 * ③其他消化酶消化法：链霉蛋白酶、黏蛋白酶、透明质酸酶等。 ④螯合剂消化法：常用螯合剂有柠檬酸钠、EDTA-Na2等。可用不含钙、镁离子的BSS配制成0.02%溶液。EDTA适于消化传代细胞，不受血清抑制，消化后需彻底清洗。 * （三）培养方法 1.组织块培养法：简便，成功率较低 2.单层细胞培养法:将解离得到的细胞用培养液配制成一定密度的细胞悬液，接种培养。 3.悬浮细胞培养法：指细胞悬浮在培养液中生长增殖的培养方法。少数动物细胞（血液和淋巴组织细胞等非贴壁动物细胞）可悬浮生长，采集组织分散、过滤、离心、纯化、漂洗后接种培养。 4.3.2 传代培养 传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。 动物细胞培养类型: 非贴壁培养：也叫悬浮培养。用于血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等的培养，可在培养液中悬浮生长。 贴壁培养：大多数动物细胞需贴附于带适量正电荷的固体或半固体表面进行培养。 * * 贴壁生长细胞的传代（消化法）： 要求细胞覆盖80%以上 吸出旧的培养液。用不含钙、镁离子的BSS溶液清洗。 加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液解离细胞。 2-5min检查，如有细胞间隙变大，加入蛋白酶抑制剂或血清培养液终止消化。 离心，弃上清液，加入Hanks液漂洗两次。 吸管轻轻吹打，加入新鲜培养液，制成悬液，计数并调整其密度。 重新接种培养。 2. 半悬浮生长细胞的传代 消化法或直接吹打法 3. 悬浮生长细胞传代 离心法：培养物转移到离心管，10