52《多聚酶链式反应扩增DNA片段》参考课件.ppt

（四） PCR(多聚酶链式反应） 1、 DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物 2、 DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 3、 PCR原理 ①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 ③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化 4、 Taq DNA聚合酶的应用 5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出 6、 PCR技术的特点 7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 体内DNA的复制 体外的模拟 模板（母链） 细胞内源 外源加入 引物 引物合成酶 外源加入 底物dNTP 细胞内源 外源加入 聚合酶 细胞内源 外源加入 反应环境 细胞内环境 缓冲液 ① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸 8、细胞内复制和PCR不同点 ② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 （五） PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸 ①变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备 2、循环过程 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步 ：加热变性 ②复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 ③延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 循环次数 DNA数量 1 2 2 4 3 8 20 1,048,576 30 1,073,741,824 3、30次循环后靶序列扩增的数量 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸 二、 PCR 的实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 PCR仪 微量离心管 微量移液器 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 ①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 ②注意： 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s 4、离心 5、反应 ②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94℃ 10min － － 30次 ９4℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 1min 最后一次 ９4℃ 1min 55℃ 30s 72℃ 1min