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拟南芥可溶性全蛋白的双向电泳 前言 双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。 第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），即利用蛋白质的分子量（Mr, 相对分子量）差异将蛋 白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。 双向电泳技术在蛋白质组学领域里得到了大量的应用，利用该技术可对一种样本中的许多蛋白质同时进行系统化的分离、鉴定、定量。双向电泳在这一领域中的应用也正是因为其同时分离数千种蛋白质的无与伦比的能力，同时，该技术还可检测翻译后和翻译过程中的蛋白质修饰，这是无法通过基因组序列分析进行预测的。双向电泳技术的应用领域有蛋白质组分析、细胞鉴别、疾病标志物探测、治疗监测、新药发现、癌症研究、纯度检测、以及微量蛋白质纯化等。 方法步骤 样品的制备 一般性原则 样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则： 尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失； 进行细胞或组织破碎时，必须最小限度地减少蛋白质水解和其他形式的蛋白降解。有可能的话，在尽可能低的温度下进行细胞破碎，并尽量减少破碎过程中热量的产生。理想情况是，细胞破碎应当直接在含有蛋白酶抑制剂的强变性溶液中进行； 减少对蛋白质的人为修饰，为了防止蛋白质的修饰，不要在加入尿素后加热样本。如果样本中存在尿素，溶液温度不能超过37℃。温度上升会使尿素水解为异氰酸酯，异氰酸酯能通过氨基甲酰化作用（carbamylation）对蛋白质进行修饰，造成人为的“斑点串（charge trains）”； 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态； 尽可能保持样本的质量，应在等电聚焦之前新鲜制备，或将样本分批保存在-40℃以下的环境中。不要使样本反复冰冻和融化。 根据这些原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP） 等。当然，也可以选择性的加入Tris-base, 蛋白酶抑制剂（ 如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor cocktails ）以及核酸酶。 样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2-DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这些都会造成2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析则可以降低盐浓度，但所需时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。 拟南芥可溶性总蛋白的提取 试剂配制 Extraction buffer 试剂 工作 浓度 母液浓度 ml/100ml ml/10ml Tris- HCl pH 8.0 20 mM 200 mM 10 1 EDTA 1 mM 10 mM 10 1 NaCl 20 mM 200 mM 10 1 MgCl2 5 mM 50 mM 10 1 DTT 10 mM 100 mM 10 1 PMSF 2 mM 100 mM 2 0.2 Leupeptin 1 μg/ml 1 mM 0.203 0.02 Aprotinin 10 μg/ml 10 mM 0.015 0.0015 Chymostatin 1 μg/ml 0.5 mM 0.331 0.033 磷酸酶抑制剂混合物 1% 100 × 1 0.1 去离子水 To 100 ml To 10 ml Lysis buffe