酵母双杂交 张娟娟.docVIP

酵母双杂交 -80保存的AH109菌种分别于YPD固体培养基上划线，2-3d； 挑取比较健康的单克隆，接入50ml YPD液体培养基中，30℃，200rpm, 过夜培养至OD6001.5（16~18h）； 取适量过夜菌液接种于100ml新鲜的YPD液体培养基中，至OD600=0.1-0.2，30℃，200rpm培养至OD600=0.4-0.6(约3~5hr)； 室温离心3500rpm，5min,弃上清；加入25-50ml ddH2O或TE重悬洗涤酵母沉淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次； 沉淀用1.5ml 1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞； 准备下列试剂： 3×转化反应 10×TE 10×LiAc 50%PEG ddH2O 1×TE/LiAc 1.5ml 150ul 150ul / 1.2ml PEG/LiAc 2.0ml 200ul 200ul 1.6ml / 1×TE 1.0ml 100ul / / 900ul （离心时间配制试剂刚好，注意上表中给出的是3×转化反应的量，根据具体情况调整。）； G.每管加入100ul用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀； H.分别加入质粒，每个质粒加3~4ul(500ng),阳性对照为pGBKT7-53和pGADT7-T,阴性对照为pGBKT7-lam和pGADT7-T； I.分别加入3ul Sperm DNA（10mg/ml），Sperm DNA新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20℃； J.分别加入600ul PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30℃，200rpm振荡培养30min； K.分别加入70ul DMSO,缓缓倒置混匀（不能振荡），42℃水浴，热激15min，热激期间可颠倒混匀，迅速插入冰浴冷却1-2min； L.室温离心14000rpm,30s，尽量吸净上清，各以0.1ml 1×TE或水重悬沉淀细胞，涂布于SD/-Trp/-Leu固体培养板，30℃倒置培养3d. M.从二缺板上挑取数个单克隆，重悬在水中，分别稀释一定梯度，100，10-1，10-2。点在SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal/3AT板上，3AT具体浓度视自激活程度而定。30℃培养1周以内观察。