拟南芥总蛋白简易提取.docxVIP

拟南芥总蛋白简易提取 前言 植物蛋白提取一般遵循如下基本原则：尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；减少对蛋白质的人为修饰；破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。 试剂 2×SDS loading buffer without loading dye (200mL) 1mol/L Tris-HCl, pH6.8 20mL SDS 8g β-ME 2.86mL 甘油 40mL 1mol/L Tris-HCl pH6.8 (100mL) Tris 碱 12.11g 用浓HCl调pH至6.8后加水至100mL 2×SDS loading buffer with dye（100mL） 1mol/L Tris-HCl pH6.8 10mL SDS 4g β-ME 1.43mL 甘油 20mL 溴酚蓝 0.2g 80%丙酮（200mL） 方法步骤 取目的材料加入液氮中研磨。 加入2×SDS loading buffer without loading dye 260μL，混匀。 在沸水浴5~10 min (加热灭活蛋白酶)。 18000g，10min 离心。 取200μL上清于一新的离心管中，弃沉淀。 向新离心管中加入800μL 4℃预冷的100%的丙酮，在-20℃保存 18000g离心10min，弃上清。 加80%的丙酮洗沉淀1~2遍 （清洗时打散沉淀）。 将离心管在空气中晾干（不能过度干燥，过度干燥会导致大量蛋白不溶解）。 加入50~100μL 1×SDS loading buffer with dye（如要进行蛋白定量，则应加入50~100μL 1×SDS loading buffer without dye）。 -80℃ 说明 研磨过程中要将离心管放回在液氮中以维持管中温度，防止材料融化后降解； 沸水浴时不要盖水浴锅锅盖，以免离心管盖子炸开； 离心后取上清时尽量不要接触到管底的沉淀；