酵母双杂交文库筛选流程_mating法.docx

核体系酵母双杂mating SOP 实验流程总览 实验材料 培养基 SD/–Trp固体培养基 SD/-Trp液体筛选培养基 SD/–Leu固体培养基 SD/–Trp/X-α-Gal/AbA固体筛选培养基 SD/–Trp/X-α-Gal固体筛选培养基 SD/–Leu/–Trp固体筛选培养基 SD/–Leu/–Trp/–His/X-α-Gal/AbA固体筛选培养基 SD/–Leu/–Trp/–His/–Ade/X-α-Gal/AbA固体筛选培养基 YPDA固体培养基 YPDA液体培养基 YPD Plus液体培养基 酵母菌株 Y2H Gold酵母菌株(Bait菌株) Y187 Yeast菌株(Prey菌株) 质粒 pGBKT7-53阳性对照Bait质粒 pGBKT7-Lam阴性对照Bait质粒 pGADT7-T阳性对照Prey质粒 pGBKT7 Bait空白载体 试剂 DMSO 10 X TE Buffer 1 M LiAc 50% PEG 0.9% NaCl Single-stranded carrier DNA 二、实验步骤 （一）诱饵基因自激活和毒性检测 以质粒PGBKT7-Lam Control Vector和PGADT7-T Control Vector为阴性对照，质粒PGBKT7-53 Control Vector和PGADT7-T Control Vector为阳性对照。 将Y2H Gold酵母菌种在YPDA平板上划线，30℃倒置培养3天左右，直到克隆大小为2-3mm； 挑取一个酵母克隆于3ml的YPDA培养基中（15ml灭菌的离心管）；在30℃摇床振荡培养8h； 吸取5ul至50 mlYPDA中（250 ml三角瓶），在30℃摇床230–250 rpm 振荡培养16-20h，直至OD600 达到0.15–0.3。 室温700 x g 离心5min 以收集菌体； 倒去上清并用100 mlYPDA重悬酵母；在30℃摇床230–250 rpm 振荡培养3-5h (OD600 = 0.4–0.5)； 室温700 x g 离心5min 以收集菌体，倒去上清并用60 ml无菌去离子水重悬酵母； 室温700 x g 离心5min 以收集菌体，倒去上清并用3 ml of 1.1X TE/LiAc溶液重悬酵母； 将重悬液分装为3个1.5ml的离心管；高速离心15 s； 倒去上清并将酵母重悬于600 ul1.1X TE/LiAc 溶液。 按照下表构建反应 反应 质粒1（各100 ng） 质粒2（各200 ng） 1 PGBKT7-53 PGADT7-T 2 PGBKT7- Lam PGADT7-T 3 BD 4 pGBKT7 每管反应中加入5 μl预变性的Carrier DNA，300 μl 1 x TE /LiAc/PEG4000，混匀。 每管反应中加入50 ul 重悬酵母感受态细胞，轻混匀。 30℃水浴30 min，每10 min 每管加入20 μl DMSO，混匀。 42℃水浴热激15 min，每5 min 700 x g离心5min。 弃掉上清，用1 ml YPD Plus液体培养基重新悬浮。 注：YPD Plus是特别配制的增强转化。这个步骤不使用YPD培养基。 30℃摇床复苏培养，合适时间（1 h）。 高速离心15 s。 弃掉上清，用100 ul NaCl (0.9%)溶液重新悬浮细胞。取10 ul重悬液，稀释100X后，按照下表涂布100 mm平板。 反应 SD-trp SD-trp/X-α-gal SD-trp/X-α-gal/AbA SD-trp-leu/X-α-gal 1 50 ul 2 50 ul 3 50 ul 50 ul 50 ul 4 50 ul 21．预期结果（BD不存在自激活） 反应 培养基类型 是否存在克隆 克隆颜色 1（阳性对照） SD-trp-leu/X-α-gal 是 蓝 2（阴性对照） SD-trp-leu/X-α-gal 是 白 3（BD自激活检测） SD-trp 是 白 3（BD自激活检测） SD-trp/X-α-gal 是 白 3（BD自激活检测） SD-trp/X-α-gal/AbA 是/否 白/无 4 （空白BD载体） SD-trp 是 白 注：1. 如果您的BD基因能够激活AbAr报告基因，即在SD-trp/X-α-gal/AbA培养基上有蓝色克隆出现，可以进一步检测其是否能够激活His3/Ade2。如果您的BD基因能够激活所有的报告基因，则不能直接进行后续双杂筛选实验。 如果您的Bait蛋白对酵母细胞有毒性，表现为携带bait载体的克隆比携带空载体pGBKT7的克隆要小得多。 （二）mating法双杂交文库筛选 挑取大小2-3 mm含有Bait质粒的Y